血清hepcidin在诊断类风湿关节炎合并慢性病贫血中的价值

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·临床论著· 血清hepcidin在诊断类风湿关节炎 合并慢性病贫血中的价值

谢坤莹 魏锦 谭竞 赵攀

【摘要】 目的 探讨血清hepcidin在诊断类风湿关节炎（RA）合并慢性病贫血中的价值。筛查RA患者的血红方法 川北医学院附属医院2012年6月至2013年9月的住院RA患者60例，

蛋白（Hb）。收集RA合并贫血患者的血清，检测铁蛋白、转铁蛋白、总铁结合力等铁代谢相关的指标。通过骨髓涂片细胞内外铁水平排除绝对铁缺乏的患者。其中RA无贫血患者20例，RA合并慢性病贫血的患者27例，对其进行纵向随访研究。以ELISA方法检测患者血清hepcidin-25。治疗过程中定期检查患者血常规、SR、CRP、hepcidin-25水平。结果 （1）RA合并慢性病贫血患者组外周血hepcidin-25水平（[56.78±38.26）ng/ml]明显高于健康对照组（[15.46±7.35）ng/ml，t=3.986，P=0.007]，RA患者无贫血组hepcidin-25水平[（46.37±45.65）ng/ml]明显高于健康对照组[（15.46±7.35）ng/ml，t=4.213，P=0.005]，RA合并慢性病贫血患者组hepcidin-25水平与RA患者无贫血组比较则无统计学差异（t=1.231，P=0.286）。（2）RA患者hepcidin-25水平与Hb不相关（r=0.105，P=0.843）。（3）RA合并慢性病贫血患者治疗后Hb水平[（87.50±13.66）g/L]明显高于治疗前[（74.42±19.62）g/L，t=4.132，P=0.006]。治疗前后hepcidin-25水平在不同的患者没有表现出规律的变化趋势，呈下降、升高或无明显变化的三种趋势。结论 类风湿关节炎患者的贫血程度与hepcidin-25水平不相关。慢性病贫血患者的hepcidin-25水平也不能反映贫血程度。本研究证实慢性病贫血的发生机制是多因素的，铁代谢异常只是其中之一，以铁代谢指标hepcidin-25作为其慢性病贫血的诊断指标并不可靠。

【关键词】 关节炎，类风湿； 铁代谢障碍； 慢性病贫血； Hepcidin-25

Diagnostic value of serum hepcidin in rheumatoid with chronic disease anemia Xie Kunying, Wei Jin, Tan Jing, Zhao Pan. Department of Hematology, the Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, China

Corresponding author: Wei Jin, Email: 1497058875@qq.com

【Abstract】 Objective To evaluate the diagnostic value of serum hepcidin in the diagnosis of anemia of chronic disease (ACD) in patients with rheumatoid arthritis (RA). Methods Rheumatoid arthritis patients were screened for the Hb, ESR, CRP. Serum samples from anemia patients were tested for ferritin, transferrin, total iron binding capacity. Iron deficiency was made based on no stainable marrow iron. 47 RA patients were enrolled into this longitudinal follow-up study. Hepcidin-25 was tested through ELISA. ESR, CRP, hepcidin-25 were monitored during the treatment of RA. Results (1) Hepcidin-25 level was higher in RA with ACD [(56.78±38.26) ng/ml] than healthy control [(15.46±7.35) ng/ml] (t=3.986; P=0.007), Hepcidin-25 level was higher in RA without anemia [(46.37±45.65) ng/ml] than healthy control (t=4.213; P=0.005), no difference of hepcidin-25 level between RA with ACD and RA without anemia (t=1.231; P=0.286); (2)The levels of hepcidin-25 were not correlated with Hb (r=0.105, P=0.843); (3) Hb level was higher after anti-rheumatic treatment than basement [(87.50±13.66) g/L vs. (74.42±19.62) g/L] (t=4.132; P=0.006). Hepcidin-25 level represented different fluctuation tendency after anti-rheumatic treatment. Conclusions The degree of anemia in patients with RA is not related to the level of hepcidin-25. The level of hepcidin-25 in patients with ACD can not reflect the degree of anemia. Our study confirms that the pathogenesis of ACD is multifactorial, and the abnormal iron metabolism is

DOI:10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2017.06.009

作者单位：637000 四川南充，川北医学院附属医院血液科 通信作者：魏锦，Email: 1497058875@qq.com

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only one of these, so it is not reliable that hepcidin-25 is treated as diadynamic criteria in the diagnosis of ACD.

【Key words】 Arthritis, rheumatoid; Iron metabolism disorders; Anemia of chronic disease; Hepcidin-25

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）合并贫血在临床上较常见，慢性炎症及缺铁是导致类风湿贫血的主要原因。铁元素作为红细胞生成的重要成分，其吸收和利用障碍都将影响红细胞生成而导致贫血。hepcidin作为铁代谢重要的调节因子，其通过抑制肝细胞、巨噬细胞释放铁及肠道上皮细胞吸收铁，从而影响机体对铁的吸收和利用。目前认为类风湿关节炎患者的高水平炎症因子诱导hepcidin分泌增加，从而影响红细胞铁代谢，形成慢性病性贫血。有研究进一步提出用血清hepcidin作为诊断类风湿关节炎患者慢性病贫血原因的指标。鉴于诸多因素参与类风湿关节炎贫血的发生过程，所以我们认为将hepcidin作为鉴别类风湿贫血原因指标的价值还有待做进一步深入的研究。

对象与方法

1. 对象：川北医学院附属医院2012年6月至2013年9月的住院类风湿关节炎患者60例，男女各半，年龄在18～70岁，类风湿关节炎患者符合2009年美国风湿病协会（American College of Rheumatology，ACR）和欧洲风湿防治联合会（European League Against Rheumatism，EULAR）联合颁布的类风湿关节炎分类新标准。对所有患者均检测其血常规，男性的血红蛋白＜120 g/L，女性的血红蛋白＜110 g/L，定义为贫血。经过部分患者同意后，在贫血患者组检测铁蛋白、血清转铁蛋白、总铁结合力、骨髓涂片细胞内外铁。把骨髓细胞外铁阴性、内铁降低的患者归为类风湿关节炎合并缺铁贫血，将其从类风湿关节炎合并慢性病贫血（anemia of chronic disease，ACD）组中排除，骨髓细胞外铁阳性、细胞内铁不低，同时排除了溶血与肾性贫血的患者归为类风湿关节炎合并慢性病贫血组。其中类风湿关节炎无贫血患者20例，类风湿关节炎合并慢性病贫血的患者27例。健康成年人自愿者20名，来自体检中心，年龄18～70岁，男女各半，作为健康对照组。

2. 主要试剂：hepcidin ELISA试剂盒，北京乐博生物科技有限公司。IL-6 ELISA试剂盒，武汉优尔生科技股份有限公司。

3. 主要仪器：离心机，－20 ℃、－80 ℃冰箱，37 ℃水浴箱，酶标定量测试仪。

4. hepcidin的ELISA测定：（1）收集类风湿关节炎合并慢性病贫血患者组、类风湿关节炎无贫血患者组与健康对照组外周血浆，采用EDTA抗凝[同时收集同一批次外周血测定的血红蛋白（Hb）]，离心2 000 r/min 15 min，收集上清液，将其放置于－80 ℃冰箱中，按一次用量分装，避免反复冻融。（2）待标本收集完毕，试验前，提前20 min将其从冰箱中取出，放置室温下解冻，平衡至室温。（3）标准品的稀释及加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、二孔中分别加标准品100 μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50 μl，混匀，然后从第一孔、第二孔中各取100 μl分别加到第三孔、第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50 μl，混匀，然后在第三孔和第四孔中先各取50 μl弃掉，再各取50 μl加到第五、六孔中，再在第五、六孔中分别加标准品稀释液50 μl，混匀，混匀后从第五、第六孔中各取50 μl分别加到第七、八孔中，再在第七、八孔中分别加标准品稀释液50 μl，混匀后从第七、八孔中各取50 μl分别加到第九、十孔中，再在第九、十孔中分别加标准品稀释液50 μl，混匀后从第九、十孔中各取50 μl弃掉（稀释后各孔加样量都为50 μl，浓度分别为120、80、40、20、10 g/L）。（4）加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40 μl，然后再加待测样品10 μl（样品最终稀释度为5倍）。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。（5）温育：用封板膜封板后置37 ℃温育30 min。（6）配液：将30倍（48T的20倍）浓缩洗涤液用蒸馏水30倍（48T的20倍）稀释后备用。（7）洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每空加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。（8）加酶：每孔加入酶标试剂50 μl，空白孔除外。（9）温育：同操作（5）。（10）洗涤：同操作（7）。（11）显色：每孔先加入显色剂A 50 μl，再加入显色剂B 50 μl，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。（12）终止：每孔加终止液50 μl，终

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止反应（此时蓝色立转为黄色）。（13）测定：以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度

（14）（OD值）。测量在加终止液后15 min内进行。

结果判断：每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值，并绘制标准曲线。以标准品浓度为横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

5. 统计学分析：实验数据采用SPSS 13.0统计软件进行分析。文章及图表当中的数据均采用均数±标准差（x±s）表示，其中两样本的比较应用t检验，相关分析应用Spearman检验，检验标准取P=0.05，当P＜0.05时，差异有统计学意义。

结 果

1. 各组hepcidin-25的水平：通过ELISA测定类风湿关节炎合并慢性病贫血组、类风湿关节炎无贫血组、健康对照组外周血hepcidin水平，类风湿关节炎合并慢性病贫血组外周血hepcidin-25水平（[56.78± 38.26）ng/ml]明显高于健康对照组[（15.46±7.35）ng/ml，t=3.986，P=0.007]。类风湿关节炎无贫血组hepcidin-25水平[（46.37±45.65）ng/ml]明显高于健康对照组[（15.46±7.35）ng/ml，t=4.213，P=0.005]。类风湿关节炎合并慢性病贫血组hepcidin-25水平与类风湿关节炎不贫血组比较则无统计学差异（t=1.231；P=0.286），见图1。

2. 相关性分析：检测所有类风湿关节炎的患者hepcidin-25与Hb的相关性，结果显示类风湿关节炎患者hepcidin-25水平与Hb不相关（r=0.105，P=0.843），见图2。

3. 类风湿关节炎合并慢性病贫血患者治疗前后Hb变化情况：结果对12例类风湿关节炎合并慢性病贫血患者治疗前后Hb水平进行比较时，发现治疗前患者Hb水平[（74.42±19.62）g/L]明显低于治疗后[（87.50±13.66）g/L]，二者差异具有统计学意义（t=4.132；P=0.006）。

4. 类风湿关节炎合并慢性病贫血患者Hb及hepcidin-25随访：对类风湿关节炎合并慢性病贫血的患者，予以慢作用药物来氟米特、甲氨蝶呤、抗肿瘤坏死因子受体抗体融化蛋白等抗风湿治疗，改善风湿病情，建议患者治疗结束后每2周随访一次，在随访过程中，检测其Hb及hepcidin-25水平。对于其中一些随访次数≥3次的患者，通过双坐标，直观表示患者Hb与hepcidin-25的变化趋势，可以看出

所有的慢性病贫血患者Hb随治疗后开始上升，而

hepcidin-25水平没有随治疗后Hb的变化而出现规律性的变化。例1患者hepcidin-25水平随着Hb上升而表现为先上升后下降（图3A）；例2患者hepcidin-25水平随Hb的上升表现为先短暂下降，然后上升，最后下降（图3B）；例3患者Hb明显上升后其hepcidin-25水平较基础值上升（图3C）；例4患者hepcidin-25水平随着Hb的上升而逐渐下降（图3D）；例5患者hepcidin-25水平随着Hb上升而表现为先上升后下降（图3E）；例6患者hepcidin-25水平随着Hb上升而表现为先下降后上升，但总较基础值低（图3F）。

讨 论

类风湿关节炎患者合并贫血的发生率较高，而贫血会影响到患者的体能状态及生活质量，因此对类风湿患者贫血的诊治成为临床医师所面临的重要问题。引起类风湿关节炎患者贫血的主要因素是慢性炎症和缺铁。所以治疗慢性炎症引起的贫血以控制炎症为主，缺铁的患者则需要补铁，因此鉴别患者贫血原因就尤为重要。通常是以铁蛋白、血清转铁蛋白、血清铁、总铁结合力等铁代谢相关指标来鉴别缺铁性贫血和慢性病贫血。然而，类风湿关节炎患者往往又同时存在慢性炎症和缺铁；除此之外，上述指标还会受到炎症因子和体内铁负荷的双重调节，因此，如果仅以上述指标来鉴别类风湿关节炎患者的贫血原因就会比较困难。骨髓铁染色作为判断患者是否有绝对铁缺乏的“金指标”，而通过骨髓涂片骨髓细胞外铁检查来明确是否是缺铁性贫血不会受到炎症影响，结果比较可靠。本研究以患者骨髓细胞内外铁水平来作为区分患者是否有缺铁的指标，将贫血患者分为类风湿关节炎合并缺铁性贫血组与类风湿关节炎合并慢性病贫血组，从而在研究hepcidin与慢性病贫血的关系中排除铁水平对hepcidin的影响。

hepcidin作为一种联系炎症与铁代谢的蛋白质，被认为是参与慢性病贫血发病过程的重要因素。炎症刺激因子IL-6通过刺激肝脏合成hepcidin，而hepcidin与其受体膜铁转运蛋白特异结合的缺铁性贫血患者，hepcidin和Hb呈负相关。Theurl等[4]在试验中发现，慢性病贫血患者hepcidin水平明显高于缺铁性贫血及慢性病贫血合并缺铁性贫血患者。而我们的研究也发现类风湿关节炎患者无论是否贫血，其hepcidin水平都较健康人高，然而，类风湿关节炎合

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并慢性病贫血组的hepcidin水平和没有贫血的类风湿关节炎患者比较没有显著差异，而且，hepcidin水平与Hb的水平也没有相关性结合，致使铁转运蛋白内吞，从而造成机体可利用铁下降，细胞膜上的铁转运蛋白减少，导致细胞内铁流出减少[1]，致使肝细

胞、巨噬细胞释放铁及肠道上皮细胞吸收铁均减少，从而导致外周血中血清铁含量降低，但人体内的储存铁含量并不低，从而出现功能性铁缺乏，铁不能够被Hb利用，幼红细胞成熟障碍，形成慢性病贫血[2]。hepcidin曾被许多研究用来探讨在鉴别慢

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性病贫血中的诊断价值。如Demirag等[3]研究发现类风湿关节炎合并贫血患者的hepcidin明显高于正常对照者及单纯缺铁性贫血。由此推断，高水平的hepcidin不一定导致慢性病贫血，而慢性病贫血的患者hepcidin也不一定高。该试验结果虽然与上述提到的研究结果相反，但是，也有研究结果支持我们，如：Sellam等[5]在研究中指出hepcidin与Hb水平并不存在相关性，van Santen等[6]也发现血清hepcidin与Hb不相关，与铁蛋白及可溶性转铁蛋白受体呈正相关。

炎症导致铁利用障碍仅仅是类风湿关节炎合并慢性病贫血的发病机制之一。hepcidin有可能是导致慢性病贫血发病的因素之一，但绝非唯一因素。引起不同患者发生慢性病贫血的主要原因不同，有的患者贫血主要原因可能是hepcidin导致铁利用障碍所造成，而有的患者贫血主要原因可能是红细胞寿命的缩短，而有的又可能是红系祖细胞生成受到了炎症因子的抑制。由此推断，如果单纯靠铁代谢指标hepcidin是不能完全准确反映患者是否存在慢性炎症性贫血的。

通过对类风湿关节炎合并慢性病贫血患者的抗风湿治疗纵向随访发现，类风湿关节炎经过有效的治疗，炎症得到控制后患者的Hb会上升。不同患者的hepcidin水平在治疗过程中会呈现不同的变化趋势。对同一患者而言，其Hb水平更高的时候，hepcidin可能较基础值更高或者更低。而为什么患者在类风湿治疗好转过程中hepcidin会出现不同的

变化趋势呢？我们分析发现，可能与参与hepcidin合成和红细胞生成的炎症因子不同，以及hepcidin合成和红细胞生成对炎症因子的反应性不同有关系。

综上所述，类风湿关节炎患者合并慢性病贫血是多因素导致的，它们多与炎症有关。炎症通过刺激hepcidin分泌，从而造成机体铁利用障碍并发生慢性病贫血，但hepcidin并不是导致慢性病贫血的唯一因素，以血清hepcidin-25鉴别类风湿关节炎患者炎症贫血依然是不可靠的。

参 考 文 献

[1] Nemeth E, Tuttle MS, Powelson J, et al. Hepcidin regulates cellular

iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internali- zation[J]. Science, 2004, 306(5704): 2090-2093.

[2] Raj DS. Role of interleukin-6 in the anemia of chronic disease[J].

Semin Arthritis Rheum, 2009, 38(5): 382-388.

[3] Demirag MD, Haznedaroglu S, Sancak B, et al. Circulating hepcidin

in the crossroads of anemia and inflammation associated with rheumatoid arthritis[J]. Internal Medicine, 2009, 48(6): 421-426. [4] Theurl I, Aigner E, Theurl M, et al. Regulation of iron homeostasis in

anemia of chronic disease and iron deficiedcy anemia: diagnostic and therapeutic implications[J]. Blood, 2009, 113(21): 5277-5286. [5] Sellam J, Kotti S, Fellahi S, et al. Serum hepcidin level is not an

independent surrogate biomarker of disease activity or of radiographic progression in rheumatoid arthritis: results from the ESPOIR cohort[J]. Ann Rheum Dis, 2013, 72(2): 312-314.

[6] van Santen S, van Dongen-Lases EC, de Vegt F, et al. Hepcidin and

hemoglobin content parameters in the diagnosis of iron deficiency in rheumatoid arthritis patients with anemia[J]. Arthritis Rheum, 2011, 63(12): 3672-3680.

（收稿日期：2016-10-24）

（本文编辑：梁雷）

谢坤莹，魏锦，谭竞，等. 血清hepcidin在诊断类风湿关节炎合并慢性病贫血中的价值［J/CD］. 中华临床医师杂志（电子版），2017，11（6）：914-918.