一种植物环状RNA表达框架及其应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 109355290 A(43)申请公布日 2019.02.19

(21)申请号 201811132313.7(22)申请日 2018.09.27

(71)申请人 四川农业大学

地址 611130 四川省成都市温江区惠民路

211号(72)发明人 卢艳丽　唐鑫　徐洁　王琦　周巧　

毛燕　刘天红　冯宣军　刘亚西　兰海　胡尔良　李梦璐　(74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限

公司 11002

代理人 王文君　王璐(51)Int.Cl.

C12N 15/113(2010.01)C12N 15/82(2006.01)C12N 15/66(2006.01)

(54)发明名称

一种植物环状RNA表达框架及其应用(57)摘要

本发明属于分子生物学领域，具体公开了一种植物环状RNA表达框架及其应用。所述植物环状RNA表达框架包括上游框架序列、待表达目的基因序列、下游框架序列；所述上游框架序列的核苷酸序列或其互补序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游框架序列的核苷酸序列或其互补序列如SEQ ID NO.2所示；所述待表达目的基因序列可根据实际应用需要而定。本发明通过利用植物环状RNA表达框架中的上游框架序列和下游框架序列，使含有特定目的基因的RNA能够表达并环化，解决了现有技术无法实现植物中特定目的基因环状RNA表达的不足。CN 109355290 A

权利要求书1页 说明书7页序列表3页 附图2页

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权　利　要　求　书

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1.一种植物环状RNA表达框架，其特征在于，包括上游框架序列、待表达目的基因序列、下游框架序列；

所述上游框架序列的核苷酸序列或其互补序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游框架序列的核苷酸序列或其互补序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种植物环状RNA表达载体，其特征在于，所述植物环状RNA表达载体含有权利要求1所述的植物环状RNA表达框架。

3.根据权利要求2所述的植物环状RNA表达载体，其特征在于，所述植物环状RNA表达载体的制备方法为：将所述植物环状RNA表达框架通过同源重组的方法构建到植物表达载体中。

4.根据权利要求3所述的植物环状RNA表达载体，其特征在于，在进行同源重组前，在所述植物环状RNA表达框架的两端添加植物表达载体同源臂。

5.根据权利要求3所述的植物环状RNA表达载体，其特征在于，所述植物表达载体包括但不限于pCAMBIA1302、pCAMBIA3301，pCAMBIA2300。

6.根据权利要求2～5任一项所述的植物环状RNA表达载体，其特征在于，所述植物环状RNA表达载体的构建方法包括：

(1)以玉米基因组为模板，利用以下两组引物进行分段PCR扩增，分别得到所述上游框架序列和所述下游框架序列；

第一组引物：F：5’-GTGCTCGCCTTACCGCCT-3’；R：5’-CTGCAAGAAGTAATCTAAAATCA-3’；第二组引物：F：5’-GTATGTTACCAAATTTAT-3’；R：5’-CTGCCAGAAATATACA-3’；

(2)再利用融合PCR的方法将待表达目的基因构建于所述上游框架序列和所述下游框架序列之间，得到所述植物环状RNA表达框架；

(3)将所述植物环状RNA表达框架通过同源重组的方法构建到植物表达载体中。7.根据权利要求2～5任一项所述的植物环状RNA表达载体，其特征在于，当待表达目的基因为玉米SFR6基因时，所述植物环状RNA表达载体的构建方法包括：

(1)以玉米基因组为模板，利用以下引物进行PCR扩增，得到植物环状RNA表达框架；引物F：5’-GTGCTCGCCTTACCGC-3’；引物R：5’-CTGCCAGAAATATACAT-3’；

(2)将所述植物环状RNA表达框架通过同源重组的方法构建到植物表达载体中。

8.权利要求1所述的植物环状RNA表达框架或权利要求2～7任一项所述的植物环状RNA表达载体在植物中表达特定目的基因环状RNA方面的应用。

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一种植物环状RNA表达框架及其应用

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技术领域

[0001]本发明属于分子生物学领域，具体地说，涉及一种植物环状RNA表达框架及其应用。

背景技术

[0002]环状RNA是一类不具有5’末端帽子和3’末端polyA尾巴，通过共价键头尾相连的单链环状RNA分子。随着测序技术与分子生物学技术的进步，科学家们对环状RNA进行了深入研究，发现环状RNA在不同物种中具有一定的保守性，且在不同组织和发育阶段大量稳定存在。环状RNA在高度进化过程中仍被保留下来，表明它在生物体内具有一定的功能。目前对生物体内环状RNA的研究表明，其在转录和转录后以及蛋白质翻译等过程中具有重要功能。环状RNA主要作为“海绵”吸附miRNA，少数环状RNA作为翻译的模板主导蛋白质的合成。此外，circRNA可以通过碱基互补配对机制直接其他RNA水平，也可以与相关蛋白质结合，抑制或蛋白质活性。[0003]目前，在动物体中表达环状RNA的表达载体较为多见，但未见能够在植物中表达环状RNA的研究报道。

发明内容

[0004]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种植物环状RNA表达框架及其应用。

[0005]为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：[0006]本发明首先提供一种植物环状RNA表达框架，其特征在于，包括上游框架序列、待表达目的基因序列、下游框架序列；

[0007]所述上游框架序列的核苷酸序列或其互补序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游框架序列的核苷酸序列或其互补序列如SEQ ID NO.2所示；所述待表达目的基因序列可根据实际应用需要而定。

[0008]本发明所提供的植物环状RNA表达框架可插入植物表达载体中，从而表达目的基因的环状RNA。

[0009]进一步地，本发明提供一种含有所述植物环状RNA表达框架的植物环状RNA表达载体。

[0010]所述植物环状RNA表达载体的制备方法为：将所述植物环状RNA表达框架通过同源重组的方法构建到植物表达载体中。[0011]优选在进行同源重组前，在所述植物环状RNA表达框架的两端添加植物表达载体同源臂。

[0012]本发明所采用的植物表达载体包括但不限于pCAMBIA1302、pCAMBIA3301，pCAMBIA2300等。在本发明的具体实施方式中，以pCAMBIA1302载体为例进行示例性说明。[0013]更进一步地，本发明提供一种更为具体的所述植物环状RNA表达载体的构建方法，

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包括：

(1)以玉米基因组为模板，利用以下两组引物进行分段PCR扩增，分别得到所述上

游框架序列和所述下游框架序列；[0015]第一组引物：[0016]F：5’-GTGCTCGCCTTACCGCCT-3’；[0017]R：5’-CTGCAAGAAGTAATCTAAAATCA-3’；[0018]第二组引物：[0019]F：5’-GTATGTTACCAAATTTAT-3’；[0020]R：5’-CTGCCAGAAATATACA-3’。[0021](2)再利用重叠PCR的方法将待表达目的基因构建于所述上游框架序列和所述下游框架序列之间，得到所述植物环状RNA表达框架；[0022](3)将所述植物环状RNA表达框架通过同源重组的方法构建到植物表达载体中。[0023]作为一种特殊示例，当所述待表达目的基因为玉米SFR6基因时，所述植物环状RNA表达载体的构建方法包括：[0024](1)以玉米基因组为模板，利用以下引物直接进行PCR扩增，得到植物环状RNA表达框架；[0025]引物F：5’-GTGCTCGCCTTACCGC-3’；[0026]引物R：5’-CTGCCAGAAATATACAT-3’；[0027](2)将所述植物环状RNA表达框架通过同源重组的方法构建到植物表达载体中。[0028]本发明还进一步提供了所述植物环状RNA表达框架和所述植物环状RNA表达载体在植物中表达特定目的基因环状RNA方面的应用。

[0029]本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

[0030]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

[0031]本发明的有益效果在于：

[0032]本发明首次提供了可在植物中表达特定目的基因的环状RNA表达框架。通过利用环状RNA表达框架中的上游框架序列和下游框架序列，使特定目的基因的RNA能够环化表达，形成环状RNA。解决了现有技术无法实现植物中特定目的基因环状RNA表达的不足。附图说明

[0033]图1为实施例1的环化框架示意图。

[0034]图2为实验例1中CircSFR6的PCR检测结果。[0035]图3为实验例1中CircSFR6的定量检测结果。[0036]图4为实施例2中的环化框架示意图。

[0037]图5为实验例2中使用cF和cR检测环状RNA(circSFR6+eGFP)的结果。

具体实施方式

[0038]下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出

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[0014]

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仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。[0039]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0040]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0041]实施例1

[0042]本实施例以玉米circSFR6作为待表达目的基因，说明植物环状RNA表达框架和植物环状RNA表达载体的构建，具体如下：[0043]一、植物环状RNA表达框架的构建

[0044]本发明设计的环状RNA环化框架包括上游环化框架序列，待表达的circSFR6基因序列,以及下游环化框架序列。该框架如图1所示，根据上述环状RNA环化框架的设计方案，通过设计扩增引物，以玉米根系基因组DNA为模板，利用以下引物直接进行PCR扩增，得到植物环状RNA表达框架；[0045]引物F：5’-GTGCTCGCCTTACCGC-3’；[0046]引物R：5’-CTGCCAGAAATATACAT-3’；并在环化框架两端添加载体同源臂，方便使用同源重组的方法将环化框架连接到质粒载体中。[0047]二、植物环状RNA表达载体的构建[0048]使用Nco I和BstE II两个性内切酶对pCAMBIA1302载体进行酶切线性化，将较大的载体骨架片段进行胶回收。将之前获得的待表达circSFR6基因的环化框架与载体片段，通过同源重组的方法进行连接。[0049]实验例1

[0050]本实验例用于对实施例1所构建的植物环状RNA表达载体进行功能验证。[0051]将上述构建好的过表达载体通过冻融法转入根癌农杆菌EHA105，通过菌液PCR验证后即可用于烟草叶片的转化。将含表达载体的农杆菌通过注射器侵染烟草叶片，注射52-67h后，检测环状RNA的表达情况。[0052]根据circSFR6基因序列，设计发散引物，特异性检测circSFR6引物序列为：[0053]CircSFR6-F：CGAAGATTCCCAGCATTG；[0054]CircSFR6-R：CATGGGAACGTGCAATAG。[0055]具体检测方法如下：[0056]1、提取叶片总RNA

[0057]采用Trziol的方法提取注射circSFR6环化表达载体的烟草叶片总RNA；具体步骤如下：[0058](1)取注射过的100mg烟草叶片直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，加少量液氮，再研磨，如此三次，将研磨粉末转入离心管中，加入1mL Trizol，剧烈震荡15s后室温静置5min；[0059](2)加入200μL氯仿，剧烈震荡15s后室温静置2-3min，4℃，12000r/min离心10min，收集上层水相，该步骤重复两次；[0060](3)加入500μL异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min，4℃，12000r/min离心10min，弃上清；[0061](4)所得沉淀加入75％的无RNase乙醇温和震荡洗涤，4℃，7500r/min离心5min，室

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温晾干10min后加入RNase-Free水溶解；[0062](5)通过琼脂糖电泳并结合核酸蛋白仪检测RNA样品浓度和纯度。[0063]2、将RNA逆转录成cDNA

[00]严格按照逆转录试剂盒(Takara公司)操作说明书在PCR管中加入模板RNA，随机逆转录引物等，总量20μL。

[0065]第一步是总RNA去DNA。[0066]反应体系如下：

[0067]

5xgDNA eraser BuffergDNA eraserTotal RNARNase free water[0068]反应条件：42℃2min，4℃forever。[0069]第二步是反转录反应，反应体系：

2μL

1μL1μgUp to 10μL

[0070]

[0071][0072][0073][0074]

反应条件：37℃30min；85℃5s，4℃forever。

3、PCR检测circSFR6按照PCR mix(Biomad公司)的说明书配置如下反应体系：

2XPCR MIX10μL

F(10mM)0.5μLR(10mM)0.5μLcDNA2μL灭菌水7μL总体积20μL[0075]反应条件：95℃3min预变性，循环内95℃30s变性，60-50℃30s退火，72℃延伸1min，共35个循环，PCR反应循环后72℃继续延伸3min，然后12℃保存。[0076]将PCR产物进行2％的凝胶电泳，并结合Sanger测序结果分析，相对于对照组，目标circSFR6分子成功在烟草中检测出(参见图2)。[0077]4、荧光定量检测环状RNA[0078]按照荧光定量试剂盒，具体反应体系如下：

[0079]

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[0080]

其中，荧光定量PCR反应条件为：95℃；3min；95℃2s，53.9℃2s，此步骤收集荧光信

号，45个循环，然后进行溶解曲线分析，温度60-95℃，收集荧光信号。内参引物选用L25，引物序列如下：

[0082]L25-F:CCCCTCACCACAGAGTCTGC；[0083]L25-R:AAGGGTGTTGTTGTCCTCAATCTT。[0084]荧光定量结果显示，注射环化过表达载体后，目标环状分子能有效表达环状RNA，表达量随着时间增加比未注射的烟草叶片表达量高5倍左右(图3)。[0085]实施例2

[0086]本实施例以circSFR6和eGFP为待表达目的基因，说明植物环状RNA表达框架和植物环状RNA表达载体的构建，具体如下：[0087]一、植物环状RNA表达框架的构建

[0088]本发明设计的环状RNA环化框架包括上游环化框架序列，待表达的circSFR6和eGFP基因序列,以及下游环化框架序列。该框架如图4所示，根据上述环状RNA环化框架的设计方案，通过设计扩增引物，以玉米根系DNA和含eGFP载体为模板，通过PCR的方法分段扩增上下游环化框架序列，待表达的circSFR6基因和eGFP上下游序列。通过融合PCR的方法将待表达的circSFR6基因与eGFP上下游以及上下游环化框架序列通过重叠PCR的方法连接在一起。并在环化框架两端添加载体同源臂，方便使用同源重组的方法将环化框架连接到质粒载体中。

[00]其中，扩增上下游环化框架序列时，以玉米根系DNA为模板，利用以下两组引物进行分段PCR扩增，分别得到所述上游框架序列和所述下游框架序列；[0090]第一组引物：[0091]F：5’-GTGCTCGCCTTACCGCCT-3’；[0092]R：5’-CTGCAAGAAGTAATCTAAAATCA-3’；[0093]第二组引物：[0094]F：5’-GTATGTTACCAAATTTAT-3’；[0095]R：5’-CTGCCAGAAATATACA-3’。

[0096]扩增eGFP可采用本领域常规方法进行。[0097]二、植物环状RNA表达载体的构建[0098]使用Nco I和BstE II两个性内切酶对pCAMBIA1302载体进行酶切线性化，并进行胶回收。将之前获得的待表达circSFR6+eGFP基因的环化框架与载体片段，通过同源重组的方法进行连接。[0099]实验例2

[0100]本实验例用于对实施例2所构建的植物环状RNA表达载体进行功能验证。[0101]将上述构建好的过表达载体通过冻融法转入根癌农杆菌EHA105，通过菌液PCR验证后即可用于烟草叶片的转化。将含表达载体的农杆菌通过注射器侵染烟草叶片，注射36-7

[0081]

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72h后，检测环状RNA的表达情况。

[0102]根据circSFR6+eGFP基因序列，设计发散引物，特异性检测circSFR6+eGFP引物序列为：

[0103]Circ-cF：CTATTGCACGTTCCCATG；[0104]Circ-cR：GCGCTCCTTGTACAG。

[0105]具体检测方法与实验例1中的步骤一致。[0106]1、提取叶片总RNA

[0107]采用Trziol的方法提取注射circSFR6+eGFP环化表达载体的烟草叶片的总RNA。[0108]2、将RNA逆转录成cDNA

[0109]严格按照逆转录试剂盒(Takara公司)操作说明书在PCR管中加入模板RNA，随机逆转录引物等，总量20μL。

[0110]第一步是总RNA去除DNA。[0111]反应体系如下：

[0112]

5xgDNA eraser BuffergDNA eraserTotal RNARNase free water[0113]反应条件：42℃2min，4℃forever。[0114]第二步是反转录反应，反应体系：

2μL

1μL1μgUp to 10μL

[0115]

[0116][0117][0118][0119]

反应条件：37℃30min；85℃5s，4℃forever。

3、PCR检测eGFP按照PCR mix(Biomad公司)的说明书配置如下反应体系：

2XPCR MIX10μL

F(10mM)0.5μLR(10mM)0.5μLCdna2μL灭菌水7μL总体积20μL[0120]反应条件：95℃3min预变性，循环内95℃30s变性，60-50℃30s退火，72℃延伸1min，共35个循环，PCR反应循环后72℃继续延伸3min，然后12℃保存。[0121]将PCR产物进行2％的凝胶电泳，并结合Sanger测序结果分析，相对于对照组，目标cirSFR6+eGFP分子成功在烟草中检测出(参见图5)。

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虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在

本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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序　列　表

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序列表<110> 四川农业大学<120> 一种植物环状RNA表达框架及其应用<141> 2018-09-14<160> 14<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 388<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 1gtgctcgcct taccgcctta acaactatgc ccatcactaa cggactggcg tcaactgtcc 60actctgcaat ggcctaactg gagggtggcg cacatgacat cgtaacccga gagcagatga 120ggcacaccga ggggattttt ttgatcaatc cggaaaattc gcccccgagg ggaatcaaac 180ccgggtcttg gaggtgctac tcggaagcct taaccagtag gctagatgcc ctttcgcgcc 240atgtttcttg caatatgtgc catattctag aacatgattt ctcaaccagc aactattcaa 300tttacattct tagcactaac cttttgtgca tcagttgtga tagccggtgt ttatttactt 360tttgatgatt ttagattact tcttgcag 388<210> 2<211> 533<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 2gtatgttacc aaatttatag acgctgattc ctaattagta ctccaaatga ttatgttatc 60ctaaatctca tatatgaggg agtgttactt tctatcttcg tgataattag ataattttat 120gaaagggcct ctagcgtaat ggttaagggt taaggctttc aagtagcacc tccaggttcc 180gggttcgatc cctaagcgaa tttcgggctt ggttaaaaaa atcccctcgc tgtgccccgc 240ccgctctcgg tgaacggaat cctacgcggc accctccggc tgggccgttg cagagtgggc 300agttgatcgg cccgttagtg atggcagcca aggttcgggg gttttctcgg cccggaccat 360gtttcggtct cttaatttaa taccgggagg atggtctttc cctctctggc cgagtttata 420attagataat tttgtatctc ttgttggggt gcatgtctac ccaaacccaa cttgattgag 480gccaaaggct tttgatgttc ctgtattttg ttgataatgt atatttctgg cag 533<210> 3<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 3gtgctcgcct taccgcct 18

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序　列　表

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<210> 4<211> 23<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 4ctgcaagaag taatctaaaa tca 23<210> 5<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 5gtatgttacc aaatttat 18<210> 6<211> 16<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 6ctgccagaaa tataca 16<210> 7<211> 16<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 7gtgctcgcct taccgc 16<210> 8<211> 17<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 8ctgccagaaa tatacat 17<210> 9<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 9cgaagattcc cagcattg 18<210> 10<211> 18<212> DNA

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 10cgaagattcc cagcattg 18<210> 11<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 11cccctcacca cagagtctgc 20<210> 12<211> 24<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 12aagggtgttg ttgtcctcaa tctt 24<210> 13<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 13ctattgcacg ttcccatg 18<210> 14<211> 15<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 14gcgctccttg tacag 15

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图1

图2

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图4

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