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氨基酸工艺学考试整理版

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1 作为谷氨酸发酵工业原料的水解糖液,必须具备以下条件: (1) 糖液中还原糖的含量要达到发酵用糖浓度的要求。

(2) 糖液洁净,是杏黄色或黄绿色,有一定的透光度。水解糖液的透光度在一定程度上反映了糖液质量的高低。透光度低,常常是由于淀粉水解过程中发生的葡萄糖复合反应程度高,产生的色素等杂质多,或者由于糖液中的脱色条件控制不当所致。

(3) 糖液中不含糊精。糊精并不能被谷氨酸菌利用,它的存在使发酵过程泡沫增多,易于逃料,发酵难以控制,也容易引起杂菌污染。

(4) 糖液不能变质。这就要求水解糖液的放置时间不宜太长,以免长菌、发酵而降低糖液的营养成分或产生其他的抑制物,一般现做现用。 淀粉水解方法及其优缺点:

酸解法又称酸糖化法。它是以酸 (无机酸或有机酸)为催化剂,在高温高压下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法。 优点: 用酸解法生产葡萄糖,具有生产方便、设备要求简单、水解时间短、设备生产能力大等优点。

缺点:水解作用是在高温、高压及一定酸度条件下进行的,因此,酸解法要求有耐腐蚀、耐高温、耐高压的设备。 淀粉在酸水解过程中研发生的化学变化是很复杂的,除了淀粉的水解反应外,尚有副反应的发生,这将造成葡萄糖的损失而使淀粉的转化率降低。酸水解法对淀粉原料要求较严格,淀粉颗粒不宜过大,大小要均匀。颗粒大,易造成水解不透彻;淀粉乳浓度也不宜过高,浓度高,淀粉转化率低,这些是酸解法存在的待解决的问题。 酶解法是用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的工艺。 优点:

(1) 采用酶法制备葡萄糖,酶解反应条件较温和。因此,不需耐高温、高压、耐酸的设备,便于就地取材,容易运作。

(2) 微生物酶作用的专一性强,淀粉水解的副反应少,因而水解糖液的纯度高,淀粉转化率(出糖率)高。 (3)可在较高淀粉乳浓度下水解,而且可采用粗原料。

(4)用酶解法制得的糖液颜色浅,较纯净,无异味,质量高,有利于糖液的充分利用。 缺点:

酶解反应时间较长 (48h),需要的设备较多,需要具有专门培养酶的条件,而且酶本身是蛋白质,易引起糖液过滤困难。

细胞内要积累大量的氨基酸, 采取的措施 必须解除氨基酸代谢途径中的反馈抑制;

防治合成的目标氨基酸降解或者用于合成其它细胞的成分;

若几种氨基酸有一个共同的前体,应该切断其它氨基酸的合成途径; 增加细胞膜的通透性,使得合成的氨基酸能及时释放到胞外。

氨基酸合成的调节机制:

(1)通过控制有关基因表达的控制机制 诱导:促进酶的合成。

阻遏:抑制酶的合成,包括终产物阻遏、分解代谢物阻遏和弱化调节。 (2)通过酶活性的控制机制 终产物抑制或激活。

通过辅酶水平的活性调节。 酶原的活化。 潜在酶的活化。

(3)通过细胞膜渗透性的控制 如棒杆菌、短杆菌积累谷氨酸过程中的细胞膜渗透性变化。 谷氨酸积累的理想途径:

A 一定的酵解速度,不能走向乳酸发酵 B 丙酮酸的碳架全部用于谷氨酸的合成。 C:乙酰CoA全部趋于合成柠檬酸方向。

D:α-酮戊二酸氧化能力微弱,不能转化为琥珀酸,而成为不完整的三羧酸循环。

E:不形成乙醛酸循环

F:异柠檬酸脱氢酶活性强; G:GHD强;

H:强的细胞膜透性

生物素在谷氨酸合成中的调节作用 1)·生物素对糖代谢速率的影响

生物素对糖代谢速率的影响,主要是影响糖降解速率,而不是影响EMP与HMP途径的比率。 在生物素充足条件下,丙酮酸以后的氧化活性虽然也有提高,但由于糖降解速率显著提,打破了糖降解速率与丙酮酸氧化速率之间的平衡,丙酮酸趋于生成乳酸的反应,因而会起乳酸的溢出。 2)生物素对CO2的固定反应

生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶,参与CO2固定反应,据报道,生物素大过量时(100ug/L以上),CO2固定反应可提高30%。

3)生物素对乙醛酸循环的影响

乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶受葡萄糖、琥珀酸阻遏,为醋酸所诱导。以葡萄糖原料发酵生产谷氨酸时,通过控制生物素亚适量,几乎看不到异柠檬酸裂解酶的活性。 4)生物素对细胞膜合成的调节作用。

谷氨酸生产菌形态及生理方面共同的特征: 细胞形态为球状、棒状或短杆状;

革兰氏染色阳性,无芽抱,无鞭毛,不能运动;

发酵中菌体发生明显的形态变化,同时发生细胞膜渗透性的变化; 都是需氧型微生物;

脲酶强阳性和生物素缺陷型;

CO2固定反应酶系活力强,柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶活力强; 异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱,乙醛酸循环弱; a-酮戊二酸氧化能力缺失或弱;

还原型辅酶II(NADPH2,)进入呼吸链能力弱;

依据谷氨酸合成特点,提出发酵菌株选育方法 (一)选育耐高渗透压菌株 1.耐高糖

选在20一30%葡萄糖的平板上生长好的突变株。 2.耐高谷氨酸

选育在15-20%味精的平板上生长好的突变株。 3.耐高糖、高谷氨酸

选育在20%葡萄糖加15%味精的平板上生良好的突变株。 (二)选育不分解利用谷氨酸的突变株

谷氨酸发酵,目的是积累谷氨酸。如果菌种一边合成谷氨酸,一边分解利用谷氨酸,就达不到积累谷氨酸的目的。所以必须使菌种不能分解利用谷氨酸,即选育以谷氨酸为唯一碳源菌体不长或生长微弱的突变株。 (三)选育细胞膜渗透性好的突变株 1.抗V p类衍生物

据有关资料报道,抗Vp类衍生物如香豆素、芦丁等能遗传性地改变细胞膜的渗透性。 2.选育溶菌酶敏感性突变株

谷氨酸菌对溶菌酶都不敏感。用溶菌酶破壁时,首先用青霉素预处理后才能破壁。如果经诱变处理,使菌种对溶菌酶敏感,就使菌种的细胞壁网状结构变得较松散,细胞壁对细胞膜的保护作用降低,渗透性变大。 3.选育二氨基庚二酸缺陷型突变株

二氨基庚二酸是谷氨酸菌细胞壁的组成成分,选育二氨基庚二酸缺陷突变株,限量添加二氨基庚二酸,使细胞壁合成不完整,细胞壁对细胞膜的保护作用降低,渗透性变大。

4.选育温度敏感性突变株

谷氨酸温度敏感突变株的突变位点发生在与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜结构基因上,常发生顺反子中碱基的转换或颠换,一个碱基为另一个碱基所置换,这样为该顺反子所控制的酶对温度敏感,容易受热失活,即在低温下正常表达而在高温下失活,导致细胞膜某些结构的改变。 (四)选育强化CO 2固定反应的突变株

1.选育以琥珀酸为唯一碳源的培养基上生长快、大的菌株。

以琥珀酸为唯一碳源,菌体要想生长,碳代谢必须走四碳二羧酸的脱羧反应。菌体生长越快,四碳二羧酸的脱羧反应越强,而四碳二羧酸的脱羧反应与二氧化碳固定反应是相同酶所催化的,所以以琥珀酸为唯一碳源,菌体长得越好,二氧化碳固定反应越强。 2.选育氟丙酮酸敏感性突变株

氟丙酮酸是丙酮酸脱氢酶的抑制剂,菌种对氟丙酮酸越敏感,说明菌种丙酮酸向乙酰CoA的转化反应越弱,相对地CO2固定反应比例也就越大。 (五)选育减弱乙醛酸循环的突变株

四碳二竣酸是由CO2固定反应和乙醛酸循环所提供的,减弱乙醛酸循环, CO2固定反应所占的比例就会增大,谷氨酸的产率就高。

1. 选育琥珀酸敏感型突变株

琥珀酸是乙醛酸循环关键酶异柠檬酸裂解酶的阻遏物,菌种对琥珀酸越敏感,异柠檬酸裂解酶的合成能力越弱,乙醛酸循环就越弱。

2.选育不利用醋酸的突变株

以醋酸为唯一碳源,菌种要生长,必须走乙醛酸循环。如果菌种不能利用乙酸,说明乙醛酸循环受阻。 3.利用基因工程技术,使异柠檬酸裂解酶活力降低。

(七) 选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到a-酮戊二酸代谢的突变株 (八) 选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株 生物素对Glu发酵的影响

在谷氨酸发酵中,生物素的作用主要影响谷氨酸产菌细胞膜的谷氨酸通透性,同时也影响菌体的代谢途径。 如果生物素过量,就大量繁殖而不产或少产谷氨酸,而产乳酸或琥珀酸。在生产中表现为长菌快,耗氧快,pH低,液氨消耗多。

若生物素不足,菌体长不好,谷氨酸产量也低,表现为长菌慢,耗糖慢,发酵周期长。

当供氧不足,生物素过量,发酵向乳酸发酵转换。供氧充足,生物素过量,糖代谢倾向于完全氧化。 溶解氧对发酵的影响 (一)生理学方面

氧参与生物氧化获得ATP,能量参与谷氨酸合成。

氨基酸合成过程中NAD(P)H2在氧存在下才能被氧化成NAD(P)。

1) 能量获取:谷氨酸菌为好氧菌,在生长过程中,菌体的呼吸作用需要氧气,完成生物氧化,获得生长和菌体代谢的能量ATP。

2) 代谢产物合成:氨基酸合成过程中需要氧气将还原态NAD(P)H2(还原酶)氧化成氧化态的NAD(P)(氧化酶)。当氧气不足,NAD(P)H2氧化受阻,谷氨酸生成受抑制。 (二)化学过程方面

研究认为:当DOT(溶解氧)高于临界值时溶氧对微生物的呼吸速率没有影响;而当DOT低于该值时则呼吸速率下降。

具体表现在: 菌体生长期:

1) 供养必须满足呼吸需要;

2 )当溶氧低于临界氧分压时,菌体呼吸受抑制,乳酸积累增强,谷氨酸发酵受抑制; 3) 高供氧时,菌体生长受抑制,菌体不能有效产生Glu。 谷氨酸生成期:

1 谷氨酸发酵在细胞最大呼吸速率时,Glu产量最大;

2 当供氧不足,Glu合成缓慢;

3 供氧过量,从发酵开始,菌体生长、耗糖就不良,几乎不产生Glu(高氧阻害:即超氧基O2-引起,它对细胞代谢的许多方面具有破坏性,可引起许多酶氧化)。 影响谷氨酸结晶的因素 1)谷氨酸含量 太低(< 3.5%),难以结晶 ;太高(>8.0 % ),β-型结晶比例增加 2)温度与降温速度

>30oC,β-型结晶明显增加。 3)加酸速度和终pH

加酸速度过快是β-型结晶产生的重要原因。 4)投晶种与育晶

投晶种关键:使用质量好的晶种 掌握恰当的投放时间 育晶 5)搅拌 6)残糖 7)菌体 树脂除铁

树脂除铁的基本原理

中和液中的铁与谷氨酸螯合,形成络合物形式存在。利用带有酚氧基团的树脂 (表面具有较强的配位基团)使络合铁与树脂螯合成新的更稳定的络合物,以达到除铁的目的。 树脂除铁的影响因素

1)树脂的离子形式;2)中和液中铁含量;3)树脂层高度;4)吸附流量对吸附的影响 等电点提取谷氨酸的原理

工业发酵建立以活细胞为中心的基本模式 种子菌的要求

糖蜜发酵生产谷氨酸的难点

淀粉水解糖质量对谷氨酸发酵的影响

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