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农杆菌介导大豆子叶节遗传转化的研究

来源：百家汽车网

第31卷第2期2005年2月　170～176页

作　物　学　报

ACTAAGRONOMICASINICA

Vol131,No12

pp1170-176　Feb1,2005

农杆菌介导大豆子叶节遗传转化的研究

李桂兰

1,2

　乔亚科　杨少辉　靳朝霞　李明刚

1222

(1河北科技师范学院,河北昌黎066600;2南开大学分子生物学研究所,天津300071)

摘　要:直接以农杆菌转化系统为平台,以栽培大豆(GlycinemaxL1)吉林35、中黄28、南农、铁丰29、铁丰30和开育12的子叶节为外植体,用LBA4404农杆菌(含pPC2KSA质粒)研究了影响大豆子叶节转化的因素。结果表明,大豆品种之间转化存在着差异,吉林35转化率最高,平均转化率为2116%,单次最高转化率达6112%;中黄28次之,平均转化率为

119%,单次最高转化率达3133%;南农转化率为1105%;铁丰29居第4位,转化率为0195%;铁丰30和开育12无转化植

株。用4d苗龄的子叶节,农杆菌浸染30min,共培养3d比较合适。萌发培养基和不定芽诱导培养基对转化率的影响存在交互作用,对于吉林35来说,大豆萌发培养基(G)和不定芽诱导培养基(Y)的最佳组配方式为G2+Y1(转化率6112%)和G1+Y2组合(转化率5126%)。农杆菌介导的转化系统中,转化植株的筛选方式对转化率影响很大,筛选培养初期,采用比较低的筛选浓度,在继代培养过程中逐次提高筛选压力,可以获得较好的转化效果。关键词:大豆;根癌农杆菌;子叶节;转化中图分类号:S565,Q78

StudyoftheAgrobacterium2mediatedTransformationSystemsofSoybeanCotyle2

donaryNode

LIGui2Lan1,2,QIAOYa2Ke1,YANGShao2Hui2,JINZhao2Xia2,LIMing2Gang2

(1HebeiNormalUniversityofScience&Technology,Changli066600,Hebei;

InstituteofMolecularBiology,NankaiUniversity,Tianjin300071,China)

Abstract:Suitablesoybeangenetictransformationsystemhasnotbeenestablishedbynow1Thefactorsinfluencing

Agrobacterium2mediatedsoybeancotyledonarynodetransformationwerestudiedinthisresearchsoastoimprovethetrans2

formationfrequencyofsoybean1Theresultsshowedthatthetransformationfrequencywasdifferentamongcultivarsofsoy2bean1Jilin35wasthehighestintransformationrate,Zhonghuang28wasthesecondandfollowedbyNannongandTiefeng29,andtherewasnotransformedplantinTiefeng30andKaiyu121Theaverageandthehighesttransformationratewere2116%and6112%forJilin35,and119%and3133%forZhonghuang28,respectively(Table1)1Thesuitableseedlingagewasabout4days2old(Fig15)andtheappropriatedurationofinfectionandco2culturewithAgrobacteriumwereabout30minutesand3daysrespectively(Fig14)1Therewasaninteractionbetweenthegerminationmediumandshootsregenera2tionmediumfortransformationfrequency1ThebettercombinationpatternofgerminationmediumandshootsregenerationmediumwereG2+Y1(transformationratewas6112%)andG1+Y2(transformationratewas5126%)inthisresearch(Fig16)1ThescreeningmethodhadasignificanteffectonincreasingthetransformationfrequencyoftheAgrobacterium2me2diatedtransformationsystem(Table2)1Kanamycinwasusedasascreeningagentinthisstudy1HighertransformationratewasobtainedbyusingthescreeningmodelS1whichthekanamycinconcentrationincreasedgraduallyfrom60mgΠLto100mgΠLwhensubcultureintheshootsregenerationstage1Itwassuggestedthatthelowerconcentrationofscreeningagentshouldbeusedintheearlierscreeningstage,thenthehigherconcentrationsincreasedgraduallyinthelaterstages1Keywords:Soybean;Agrobacteriumtumefaciens;Cotyledonarynode;Transformation

　　早在1984年,Deblock和Horsch就进行了大豆转基因研究

[1]

法获得大豆转基因植株

[2]

,现在抗除草剂转基因大

,1988年Hinchee首先以农杆菌介导豆虽然已经商品化,但大豆转化的频率仍很低,重复

基金项目:河北省自然科学基金(301295);国家863资助(2002AA213061);河北省科技攻关项目;河北科技师范学院博士基金。

作者简介:李桂兰,女,博士,教授。

Received(收稿日期):2004203220,Accepted(接受日期):20042082221

　第2期李桂兰等:农杆菌介导大豆子叶节遗传转化的研究　　　171

性很差,到目前为止还没有建立起良好的大豆转基因系统。

建立一个良好的组培再生系统,是大豆遗传转化成功的前提。多数研究者把组培再生系统和遗传转化系统孤立起来研究,一般首先对大豆子叶节组培系统作比较详细的研究,然后从中选择最佳的组培条件直接应用于农杆菌转化。但是,组培再生系统和遗传转化系统在对外植体的处理上存在着很大的差别,遗传转化系统中农杆菌的浸染、不定芽诱导过程中筛选剂的抑制影响以及外植体对农杆菌的感受时期等因素造成两种系统并不能完全统一,一个良好的组培系统不一定是一个优秀的遗传转化系统

[3]

113　方法

11311　外植备　　大豆种子消毒后接种于萌

发培养基上,发芽4～10d后,选择无污染的幼苗,保留2mm下胚轴区域,沿2片子叶中间纵切子叶

节,将2片子叶分开,切去顶芽及侧芽,保留完整的子叶,在子叶的叶腋处划6～8刀制造伤口,切好的外植体放入培养皿中,备用。11312　菌液的准备　　挑取单菌落接种到LB液体培养基中,27℃培养至OD600为016～018,转入新鲜的LB培养基中(含20μmolΠL的乙酰丁香酮),培养至OD600达到013～015时,5000rΠmin,4℃离心10min,菌体重悬于和大豆不定芽诱导培养基相同的液体培养基中(pH517),调到OD600为013～014,加入

。因此本试验直接以转化系统为平台,研究影

响转化效率的多种因素,旨在建立一个良好的农杆菌介导的遗传转化系统。

乙酰丁香酮至终浓度100μmolΠL。

11313　浸染与共培养　　调好的菌液加入大豆子

1　材料和方法

111　材料

叶节中,浸泡15～60min,去掉菌液,接种于相应的不定芽诱导培养基上,黑暗条件下共培养2～4d。11314　植株再生　　共培养2～4d后接种于含有

　　选用吉林35、中黄28、南农、铁丰29、铁丰30和开育12共6个栽培大豆品种。工程菌为含pPC2

KSA质粒的LBA4404(本实验室构建)。112　培养基

11211　大豆种子萌发培养基　　G1:MS+3%蔗糖+016%琼脂;G2:1Π2MS+BA110mgΠL+3%蔗糖+016%琼脂。

11212　不定芽诱导培养基　　Y1:B5+BA015mgΠL+IBA015mgΠL+3%蔗糖+018%琼脂;Y2:B5+BA110mgΠL+3%蔗糖+018%琼脂;Y3:B5+BA210mgΠL+3%蔗糖+018%琼脂;Y4:B5+BA410mgΠL+3%蔗糖+018%琼脂。

11213　筛选方式　　在不同培养阶段应用不同浓

不同浓度卡那霉素(据筛选方式而定)和250mgΠL

头孢霉素的不定芽诱导培养基上,于24～26℃、14h光照Π10h黑暗条件下培养,15d继代1次。当芽生长到1cm时,转入生根培养基,待新根、新叶长出后移栽入蛭石中。适当缩短光照时间至12h光照Π12h黑暗,促使再生植株开花结荚。11315　PCR检测　　取卡那霉素抗性再生植株的叶片,按文献[4]方法提取大豆基因组DNA,扩增无花果曲霉植酸酶基因phyA。上游引物:5′2AT2GTCTAGACTGGCAGTCCCCGCCTCGAGA23′,下游引物:5′2CTAGGTACCCTAAGCAAAACACTCCGCCCAATC23′。

L,含大豆基因组DNA100ng,PCR反应体系50μ

dNTP200μmolΠL,上游、下游引物终浓度1μmolΠL,

TaqDNA聚合酶2U。94℃预变性5min;进入循环,

度的卡那霉素(mgΠL)“,[数字]”表示相应阶段应用

的卡那霉素浓度(mgΠL)“,→”表示外植体转移到相应的培养基上。

S1:芽诱导培养基[60]→[80]→[100]→芽伸长

94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸115min,30个循环;72℃延伸10min。扩增产物于018%琼脂

培养基[80]→生根培养基[50]→[0];

S2:芽诱导培养基[60]→[90]→[120]→芽伸长

糖凝胶电泳,凝胶成像系统照相。

11316　Southern斑点杂交　　用地高辛标记无花果曲霉植酸酶基因phyA作为探针。待测大豆基因组DNA100℃水浴变性10min,吸取1μL点膜,紫外照射固定,杂交,洗膜,显色。

培养基[0]→生根培养基[0];

S3:芽诱导培养基[120]→[150]→[150]→芽伸

长培养基[0]→生根培养基[0];

S4:芽诱导培养基[200]→[200]→[200]→芽伸

2　结果与分析

211　不同大豆品种农杆菌转化的差异

长培养基[0]→生根培养基[0]。　　对6个大豆品种进行农杆菌转化,得到54株卡

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那霉素抗性植株,成活39株,提取基因组DNA,用无

花果曲霉植酸酶基因phyA的1对引物进行PCR扩增,17株抗性植株和阳性对照均扩增出约114kb的特异性条带,而阴性对照植株没有扩增出条带(图1,图2),对PCR阳性株进行Southern斑点杂交,结果显示14株为阳性(图3)。

图1大豆卡那霉素抗性植株PCR检测(南农、铁丰29、中黄28)

Fig11PCRassayofKanamycinresistanceT0plants(Nannong,Tiefeng29andZhonghuang28)

Lane1:thenegativecontroluntransformedplantsofNannong;Lane226:KanamycinresistanceplantsofNannong;Lane7-9:KanamycinresistanceplantsofTiefeng29;Lane10-17:KanamycinresistanceplantsofZhonghuang28;

Lane18:thenegativecontroluntransformedplantsofZhonghuang28;

Lane19:thepositivecontrolplasmidofpPC2KSA;Lane20:DNA500laddermarker1

图2大豆卡那霉素抗性植株PCR检测(吉林35)Fig12PCRassayofKanamycinresistanceT0plants(Jilin35)

Lane1:DNA500laddermarker;Lane2:thepositivecontrolplasmidofpPC2KSA;Lane3:thenegativecontroluntransformedplantsofJilin35;

Lane4-25:KanamycinresistanceplantsofJilin351

表1

Table1

不同大豆品种的转化差异

转化率3

Transformationfrequency(%)

2116

119011050195001136

Thedifferenceoftransformationamongcultivarsinsoybean

PCR阳性株数No1ofPCRpositiveplants

95120017

Southern阳性株数No1ofsouthernpositiveplants

84110014

品种

Cultivar

外植体总数No1oftotal

explants37021196105851001027

吉林35Jilin35中黄28Zhonghuang28

南农Nannong铁丰29Tiefeng29铁丰30Tiefeng30开育12Kaiyu12合计Total

　　注:转化率(%)=Southern杂交阳性株数Π外植体总数×100

Note:Frequencyoftransformation(%)=SouthernpositiveplantsΠTotalexplants×100

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Z:中黄28;N:南农;J:吉林35:T:铁丰29;+CK:质粒。Z:Zhonghuang28;N:Nannong;J:Jilin35:T:Tiefeng29;+CK:plastid.

图3大豆T0PCR阳性植株Southern斑点杂交Fig13SouthernblotassayofthePCRpositiveT0plants

　　转化结果表明,吉林35和中黄28的转化率最高,分别达到2116%和1190%,南农次之,为1105%,铁丰29居第4位,为0195%,铁丰30和开育12无转化植株(表1)。说明LBA4404农杆菌对

图5苗龄对转化率的影响(吉林35)Fig15Theeffectofseedlingageonthetransformedrateofsoybean(Jilin35)转化率=T0southern转化数Π外植体总数×100

Frequencyoftransformation=T0southernpositiveplantsΠTotalexplants×100

不同大豆品种的感染能力不同。

212　农杆菌浸染和共培养时间对大豆子叶节转化率的影响　　选用大豆品种吉林35进行了农杆菌浸染时间和共培养时间对转化率影响的研究,结果表明,在本试验范围内,不同浸染时间条件下,均表现为共培养3d转化率最高。农杆菌浸染时间则以30min转化率最高。共培养与浸染时间之间有互作,总的趋势是浸染时间延长则共培养适宜时间缩短(图4)。

养基,4种不定芽诱导培养基。结果表明,在不定芽诱导培养基Y1、Y2和Y3(BA浓度为015mgΠL、110mgΠL和210mgΠL)上都得到了转化植株,在Y4(BA浓度410mgΠL)培养基上没有得到转化植株。在G2萌发培养基(BA110mgΠL)上获得的子叶节,转接到低浓度BA(015mgΠL)的芽诱导培养基(Y1)上,其子叶节的转化率高于转接到BA浓度高的Y2和Y3诱导培养基上;而在无激素萌发培养基G1上获得大豆的子叶节,得到相反的结果(图6),即在BA浓度相对较高的芽诱导培养基上获得了较高的转化率。大豆萌发培养基和不定芽诱导培养基的适宜组合为G2+Y1和G1+Y2,转化率分别达到了6112%和5126%。

在含BA的萌发培养基(G2)上,大豆幼苗的胚轴和子叶节表现宽大,在以后的不定芽诱导过程中,在BA浓度高(Y2,Y3,Y4)的培养基上,刺激了不定芽的大量分化,单个外植体不定芽产生过多,有些

图4农杆菌不同浸染时间和共培养时间条件下吉林35的转化率

Fig14

Therateoftransformationofsoybean(Jilin35)cotyledonarynodeindifferentdurationofinfectionandco2culturedwithAgrobacterium

子叶节分化出的丛芽多达13～17个,这些芽细小,不易生根,最终不能成活。在不含BA的萌发培养基(G1)上获得的大豆子叶节,接种在BA含量较高的芽诱导培养基上(Y2,Y3),每个外植体发生不定芽1～2个,不定芽比较健壮,最终成苗率达到20%左右(图6)。

215　筛选方式与转化率

213　幼苗苗龄对转化率的影响

4～10d苗龄的子叶节都能获得转化植株,以4d苗龄最高,达到3153%,7d苗龄为1152%,10d苗

龄为1150%(图5)。

214　萌发培养基和不定芽诱导培养基对转化率的

吉林35在无农杆菌浸染状态下,60mgΠL的卡那霉素对子叶节产生明显抑制,不定芽的叶片黄化,变小,出芽数明显下降;当卡那霉素浓度增加到90mgΠL时,不定芽矮小、黄化,不定芽的诱导率仅2%

影响　　以吉林35为材料,设计了2种大豆种子萌发培

174　　　　作　　物　　学　　报第31卷　

左右;卡那霉素浓度达到120mgΠL时,不定芽无叶,

芽短黄化,芽数很少,不到1%的子叶出芽;卡那霉

素浓度为150mgΠL时,几乎无芽发生。

图6

Fig16

大豆种子萌发培养基和不定芽诱导培养基对吉林35转化的影响

EffectofmediumofgerminationandshootsregenerationonthetransformedfrequencyofJilin35

表2

Table2筛选方式对吉林35转化的影响

Southern阳性株数转化率

SouthernTransformedpositiveplantsfrequency(%)

33153121442118300选择方式外植体总数生芽总数生芽率

ScreeningTotalTotalRateof

modalexplantsshootsshoot(%)S1852934111S24149175S3109109117S46046167()　　注:生芽率%=生芽总数Π外植体总数×100

Note:Rateofshooting(%)=TotalshootsΠTotalexplants×100

EffectofscreeningmodalontransformationofJilin35实际生根数生根率移栽成活数T0PCR转化数RealrootingRateofSurvivedPCRpositive

()shootsrooting%plantsplant1241145437511770420000　　表2列出了吉林35不同筛选方式下不定芽的生长和转化结果,从中可以看出,吉林35在4种筛选方式下,转化率差异很大。筛选方式1的选择压力比较低,变化比较温和,筛选压力随时间的延长逐渐加大,获得比较高的外植体生芽率,达到34111%,这样就最大限度地保留了可能获得转化的

为1183%。筛选方式4选用完全抑制芽分化的卡那霉素浓度,芽分化受到严重抑制,结果没有得到转化植株。

3　结论与讨论

311　结论

芽,随后转移到含卡那霉素50mgΠL的生根培养基上,筛选20d后,将生长良好的芽继续转移到无卡那霉素的生根培养基上,10d左右长出新根,本方式获得较高的转化率,达到3153%。筛选方式2在低

筛选压力下(卡那霉素60mgΠL)的时间比较短,7d后外植体就转移到含卡那霉素90mgΠL的芽诱导培养基上,使之较早地接受高压力的筛选,生芽率比筛选方式1明显降低,转化率为2144%。筛选方式3起始筛选压力比较高,其结果和方式2相似,转化率

　　本试验直接以农杆菌转化系统为操作平台,以大豆吉林35为主要材料对影响转化率的因素作了研究,获得了比较高的转化率,吉林35平均转化率为2116%,单次最高转化率达6112%,中黄28平均转化率为119%,单次最高转化率达3133%。在本实验范围内转化率比较高的基因型是吉林35、中黄28和南农。初步摸索出以下比较好的农杆菌转化

方法。总结如下:(1)以4d苗龄大豆的子叶节作外

植体,农杆菌液浸染30min,共培养3d。(2)不定芽

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诱导方式:①大豆预萌发培养基MS+BA110mgΠL+3%蔗糖+016%琼脂和不定芽诱导培养基Y1配合;②预萌发培养基G1和不定芽诱导培养基Y2配合。(3)卡那霉素在不同培养阶段的浓度(mgΠL)选S1和S2方式。312　讨论

因转化研究中指出5～6d苗龄的子叶转化效果最

[10]

佳,苗龄长的子叶转化困难。说明不同苗龄的外植体,其器官或胚胎发生的潜力不同,苗龄小,外植体的组织能力强,处于农杆菌转化的最佳感受态时期。

多数研究表明,不定芽诱导培养基中,使用的激素种类和浓度是重要因素,BA对大豆不定芽的诱导

[11～14]

有着良好的效果。在大豆种子萌发时,BA可以刺激子叶节内源细胞素的产生,打破顶端优势,使子叶节膨大,促使分生组织,形成芽的前分生组织,以后的培养中BA浓度影响子叶节不定

[8,11]

芽的分化。但是,组培再生系统和基因转化系统在对外植体的处理上存在着很大的差别,优秀的

[3]

组培系统不一定是优秀的转化系统。因此本试验是在农杆菌转化系统中,大豆萌发培养基和不定芽诱导培养基联系起来综合比较激素浓度对转化率的影响,表明大豆萌发培养基和后续的诱导培养基对转化相互影响,不存在孤立的最佳的大豆萌发培养基和大豆不定芽诱导培养基,必须协调组配使用,才能得到良好的结果。

在植物遗传转化过程中,转化株的筛选十分关键。筛选压力小,造成过多的非转化株逃逸,增加后续转化株鉴定的工作量;筛选压力过大,则导致正常转化株也受到抑制,降低转化效率。因此,合适的筛选剂浓度和选择方式既能有效抑制非转化细胞的生长,使之缓慢死亡,又不影响转化细胞的正常生长。本试验以比较低的卡那霉素筛选浓度为起点,随后的选择压力逐渐加强,获得了较高的转化效率。从农杆菌的转化机理来分析,在子叶节外植体经过农杆菌浸染—共培养,完成农杆菌附着、T2DNA进入分生组织细胞及整合到受体基因组的过程中,初期细胞内积累的npt2Ⅱ基因的表达产物新霉素磷酸转移酶还比较少,对卡那霉素的抗性比较弱,此时过高的选择压力,会扼杀已转化的细胞。另外,一个的

[10]

转化细胞很难分化成转化体,其成细胞群也要经过一段时间。较低的选择压力则既能达到抑制非转化细胞,又能使转化细胞正常生长、、分化。这样经过一段时间的培养,转化细胞内新霉素磷酸转移酶积累量增加,可以维持在一定的水平;一个的转化细胞经过形成细胞群,抗卡那霉素的能力增强。此时再提高选择压力最大程度地抑制非转化细胞的分化,转化细胞则正常分化形成不定芽。

由此提示,农杆菌转化系统中,选择培养阶段,

本试验中,以吉林35的转化率最高,大豆品种之间转化效果不同(表1)。许多关于农杆菌转化机理的研究发现大豆一些品种对农杆菌的敏感性远远

[5～7]

高于其他品种,存在寄主基因型的特异性。Donaldson等用农杆菌介导法对几个早熟大豆品种

的子叶节和胚性愈伤组织进行的转化研究,证明了农杆菌介导的遗传转化存在菌株和寄主基因型的特

[8]

异性。因此寻找对农杆菌敏感、转化效率高的大豆模式转化材料具有重要意义。

农杆菌浸染和共培养时间在农杆菌介导的转化系统中是重要的影响因素,本试验中农杆菌浸染30min转化率最高,浸染60min次之,浸染15min转化

[9]

率最低(图4),这与周思军等的下胚轴浸染试验结果(8min最好)间存在比较大的差异,可能是所用外植体不同所致。本试验选用带一片完整子叶的子叶节作为外植体,分生组织位于子叶的叶腋处,埋藏较深,不像胚轴那样完全而直接地暴露在菌液中,因此农杆菌附着到叶腋的分生组织需要比较长的时间。胚轴和带一片完整子叶的子叶节相比,耐农杆菌浸泡能力低,随浸泡时间的延长,受到的伤害加重。因此,外植体不同,适宜的浸染时间和共培养时间也不同。

大豆苗龄同时影响子叶节不定芽的再生能力和对农杆菌的感受能力。在本研究中,大豆子叶节以苗龄4d的转化效率最高,随着苗龄的延长转化率

[3,10]

降低(图5),与其他植物中的结果相似。Meyer等研究农杆菌转化机理时指出,转化细胞只发生在细胞的一个较短的时期内,因为核基因组DNA只有在复制时才能使外源DNA整合,所以可能只处于细胞周期的S期(DNA合成期)才具有外源基因的转化能力。因此,不同发育时期的组织细胞的转化能力有着很大的差别,发育晚期的组织细胞转化能力较差,发育早期的组织细胞转化能力较强。无菌苗的年龄直接决定着组织细胞的发育时期,Torres等(1993)以生菜子叶为外植体转化时发现,1～3d苗龄的子叶效果最佳,4～5d苗龄的子叶未能得到转基因株。贾士荣等(1995)在瓜类作物的基

176　　　　作　　物　　学　　报第31卷　

根据大豆本身对所用筛选剂的敏感性,以开始抑制

芽的生长为初始的筛选浓度,在继代培养过程中逐次提高筛选压力,可以获得较好的转化效果。

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