出口家禽新城疫病毒PCR和ELISA联合检测方法的建立

维普资讯 http://www.cqvip.com 上海农业学报２００８，２４（２）：３６—３９　Ａｃｔａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅ　Ｓｈａｎｇｈａｉ　文章编号：１０００—３９２４（２００８）０２—３６—０４　出口家禽新城疫病毒ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ联合检测方法的建立　蒋凤英，李春华，王英，周宗清，张春玲，邹　勇，何锡忠，张婉华，刘　晨　（ｔ－海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海２０１１０６）　摘要：针对出Ｉ：Ｉ家禽新城疫泄殖腔棉拭样品病毒检测的需要，建立了ＰｃＲ和ＥＬＩＳＡ联合检测方法。结果　表明：检测时间较常规缩短７～１４　ｄ；通过被检样品鸡胚传代，提高了阳性检测率；特异性强，只与不同类型新城疫　病毒反应，不与其他常见禽类病毒反应；所检的３　２１６个样本，符合率９８．８％；用多重ＲＴ－ＰＣＲ和脑内接种试验两种　方法鉴定的１１４份样品，符合率９９．１　；与Ｇ朗Ｂａｎｋ中部分新城疫病毒Ｆ基因比较，同源性８１％～１（）（】　。　关键词：新城疫病毒检测；多重ＲＴ－ＰＣＲ　ＥＬＩＳＡ￣泄殖腔棉拭样品　中图分类号：Ｓ８５８．３１　文献标识码：Ａ　Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　０ｆ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ＥＬＩＳＡ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ　ｆｏｒ　Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ　ｏｆ　ｅｘｐｏｒｔ　ｐｏｕｌｔｒｙ　ＪＩＡＮＧ　Ｆｅｎｇ－ｙｉｎｇ，ＬＩ　Ｃｈｕｎ・ｈｕａ，ＷＡＮＧ　Ｙｉｎｇ，ＺＨＯＵ　Ｚｏｎｇ－ｑｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｃｈｕｎ・ｌｉｎｇ　ＺＯＵ　Ｙｏｎｇ，ＨＥ　Ｘｉ—ｚｈｏｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｗａｎ—ｈｕａ，ＬＩＵ　Ｃｈｅｎ　（Ａｎｉｍａｌ　Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ　ａｎｄ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＳＡＡＳ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０１　１０６，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ＥＬＩＳＡ　ａｎｄ　ＲＴ—ＰＣＲ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｖｉｒｕｓ（ＮＤＶ）　ｏｆ　ｅｘｐｏｒｔ　ｐｏｕｌｔｒｙ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｔｅｓｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ａ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ｍｅｔｈｏｄ．ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｃｏｕｌｄ　ｒｅｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ｔｉｍｅ　ｓｐｅｎｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｗｈｏｌｅ　ｔｅｓｔ　ｂｙ　７～１４　ｄａｙｓ　ａｎｄ　ｉｍ．　ｐｒｏｖｅ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ＮＤＶ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｃｈｉｃｋ　ｅｍｂｒｙｏ　ｐａｓｓａｇｅ　ｏｆ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．Ｔｈｅ　ｃｏｉｎｃｉ—　ｄｅｎｃｅ　ｒａｔｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｅｓｔ　ｆｏｒ　３　２１６　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ　ｗａｓ　９８．８％．Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｈａｄ　ａ　ｇｏｏｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｒｅａｃｔｉｎｇ　ｏｎ—　ｌｖ　ｔｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ＮＤＶ　ａｎｄ　ｎｏｔ　ｔｏ　ｏｔｈｅｒ　ｃｏｍｍｏｎ　ａｖｉａｎ　ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｔｈｅ　ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ　ｒａｔｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＲＴ．ＰＣＲ　ａｎｄ　ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ　ｆｏｒ　１　１　４　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ　ｗａｓ　９９．１％．Ｔｈｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｆ　ｇｅｎｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ＮＤＶ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ＮＤＶ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＧｅｎＢａｎｋ　ｗａｓ　８１％～１００％．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｔｅｓｔ　ｆｏｒ　Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ；Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＲＴ－ＰＣＲ；ＥＬＩＳＡ；Ｃｌｏａｃａｌ　ｓｗａｂ　ｓｐｅｃｉｍｅｎ　新城疫（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＤ）俗称亚洲鸡瘟，是目前危害养禽业最重要的病毒性传染病之一＿１一，　其爆发与流行不仅引起禽类大批死亡，而且爆发ＮＤ的国家，禽类产品国际贸易将受到禁止和，造成　养禽业更大的经济损失和国际影响；同时ＮＤ对人类健康构成威胁，使人感染后引发严重的结膜炎＿２］。　近年来世界范围内食品安全恶性事件频频发生，除了引起贸易争端外，还影响到社会的稳定，特别是　禽流感事件之后，公众对禽肉产品的质量要求也越来越高，为了提升我国在禽肉产品贸易中的国际声誉　和形象，保障广大消费者的健康安全，对新城疫病毒（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｖｉｒｕｓ，ＮＤＶ）特异性强的快速检　测方法进行研究成了当务之急。有关ＮＤＶ快速检测方法建立报道较多＿３—６ｊ，但由于出口家禽ＮＤＶ检测　具有准确率要求高、样品数量多、需判断强弱毒等特点，所以ＯＩＥ推荐的出口家禽ＮＤＶ检ｉ贝４方法仍是传　统的病原分离方法［７］。病原分离法虽然准确、可靠，但其操作繁琐、检测周期长，不能适应我国进出口禽　产品快速检测的需要。荧光ＲＴ—ＰＣＲ灵敏、快速，但样本检测成本高且需昂贵的仪器设备，不利于推广应　用。本研究针对出口家禽泄殖腔棉拭样品ＮＤＶ检测的特点，建立实用、准确、快速、特异的出口家禽泄殖　腔棉拭样品ＮＤＶ的检测技术。　收稿日期：２００７—０７—０９初稿；２００８—０４—０７二改稿　基金项目：上海市２００５年技术标准专项（０５ｄｚ０５０１３）资助　作者简介：蒋凤英（１９７３一），女，硕士研究生，副研究员，主要从事新城疫病毒检测工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｉａｎｇｆｅｎｇｙｉｎｇｈｆ＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ　＊通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕｃｈｅｎａ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｒｎ　维普资讯 http://www.cqvip.com ２期　上　海　农　业　学　报　３７　１材料与方法　１．１材料　１．１．１毒株新城疫病毒Ｆ４８Ｅ８、鸡禽流感病毒（ＡＩＶ）、传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）、鸡传染性支气管　炎病毒（ＩＢＶ）、鸭肝炎病毒（ＤＨＶ），由上海市农业科学院畜牧兽医研究所收集、保存，１１４个鸡泄殖腔棉　拭样品来自本市养鸡场，由本实验室采集、保存。　１．１．２　ＳＰＦ鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物有限公司。　１．１．３　１日龄ＳＰＦ雏鸡本课题组用ＳＰＦ鸡胚孵化。　１．１．４新城疫单抗及酶标抗体购自扬州大学畜牧兽医学院传染病教研室。　１．１．５标准抗原和血清鸡新城疫标准抗原和阳性血清购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（与农　业部中国兽药监察所标准相符）。　１．１．６主要试剂ＴＲＩＺＯＬ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＡＭＶ、ｄＮＴＰ等　购自上海生工公司。　１．２方法　１．２．１　样品处理　将泄殖腔棉拭子置于２　ｍＬ　ＰＢＳ液中，于一２０℃冻融３次，取１．２　ｍＬ悬液　１０　０００　ｇ／ｍｉｎ离心１０　ｍｉｎ，取上清液，按常规方法加双抗（青霉素５　０００　Ｉｕ／ｍＬ，链霉素１０　ｍｇ／ｍＬ，卡那霉　素２５０￣ｇ／ｍＬ），４　ｏＣ作用４　ｈ，血平板培养无菌后，一２０℃保存备用。　１．２．２病毒增殖试验将处理好的样品上清液经尿囊腔接种９～１　１日龄ＳＰＦ鸡胚５枚，０．２　ｍＬ／枚，置　于３７℃孵化４　ｄ，淘汰２４　ｈ内死亡的鸡胚，收集３６￣９６　ｈ内死亡胚和活胚尿囊液为Ｆ　代。　１．２．３新城疫单抗ＥＬＩＳＡ试验将收集的鸡胚Ｆ　代尿囊液按吴红专等［８］报道方法操作。　１．２．４病毒检测特异性试验用ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ联合检测方法检测不同毒力型新城疫病毒和常见禽类病毒：　鸡禽流感病毒（ＡＩＶ）、传染性法氏囊病病毒（口ＢＤｌＶ）、鸡传染性支气管炎病毒（ⅢＶ）、鸭肝炎病毒（　。　１．２．５病毒检测重复性试验随机抽取５个阳性样品，用所建立的方法进行重复性试验。　１．２．６　ＲＴ．ＰＣＲ试验　新城疫病毒引物为：Ａ：５’．ＴＴＧＡＴＧＧＣＡＧＧＣＣＴＣＴＴＧＣ一３’；Ｂ：５’．ＧＧＡＧ．　ＧＡＴＧＴＴＧＧＣＡＧＣＡＴＴ．３’；Ｃ：５’．ＡＧＣＧＴ（Ｃ／Ｔ）ＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴ．３’；Ｄ：５’．Ｇ（Ａ／Ｇ）ＣＧ（Ａ／Ｔ）ＣＣＣＴＧＴ　（Ｃ／Ｔ）ＣＣＣ．３’。　按照ＴＲＩＺＯＬ试剂盒提取病毒ＲＮＡ，ＲＴ．ＰＣＲ参考分子克隆手册进行Ｅｇ］。ＲＴ．ＰＣＲ程序为：９５℃　５　ｍｉｎ；９４℃１　ｍｉｎ，５６℃１　ｍｉｎ，７２℃１　ｍｉｎ，３５个循环；７２℃１０　ｍｉｎ，４℃程序终止。　１．２．７毒力型鉴定特异性试验用多重ＲＴ．ＰＣＲ检测不同毒力型新城疫病毒、常见禽类病毒（ＡＩＶ、ＩＢ．　ＤＶ、ＩＢＶ、ＤＨＶ）和ＳＰＦ鸡胚尿囊液。　１．２、８脑内致病指数（ＩＣＰＩ）　按ＯＩＥ（１９９６）规定的方法进行Ｌ１。Ｊ。　２结果与分析　２．１病毒增殖试验　随机挑选４个含有ＮＤＶ的鸡泄殖腔棉拭样品及其Ｆ　代尿囊液，用多重ＲＴ．ＰＣＲ进行毒力型鉴定，　从图１可见传代前只有样品１可检出很弱的目的条带，从图２可见传代后４个样品均可检出目的条带。　Ｍ　２　Ｏｏｏ　１　２　３　４　Ｍ　１　２　３　４　２　Ｏｏｏ　１　Ｏｏｏ　７５０　５０ｏ　１　Ｏｏｏ　７５０　３６２　ｂｐ　５ｏｏ　３６２　ｂｐ　２５０　１００　２５４　ｂｐ　２５０　１０ｏ　２５４　ｂｐ　１：ＮＤＶ１；２：ＮＤＶ２；３：ＮＤＶ３；４：ＮＤＶ４；　ＮＤＶ１￣ＮＤＶ４：Ｏｒｉｇｉｎａｌ　ｃｈｉｃｋｅｎ　ｃｌｏｃａｌ　ｓｗａｂ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｆｏｒ　ＮＤＶ　１～４：Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ　ｏｆ　ｃｈｉｃｋ　ｅｍｂｒｙｏｎａｔｅｄ　ａｌｌａｎｔｏｉｃ　ｆｌｕｉｄ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｆｏｒ　ＮＤＶ１，ＮＤＶ２，ＮＤＶ３　ａｎｄ　ＮＤＶ４　ａｆｔｅｒ　ｆｉｒｓｔ　ｐａｓｓａｇｅ　图１传代前多重ＲＴ－ＰＣＲ试验结果　Ｆｉｇ．１　Ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｘＲＴ－ＰＣＲ　ｐｒｉｏｒｔｏ　ｐａｓｓａｇｅ　图２传代后多重ＲＴ－ＰＣＲ试验结果　Ｆｉｇ．２　Ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｘＲＴ－ＰＣＲ　ａｆｔｅｒ　ｐ‘　蛆ｇｅ　维普资讯 http://www.cqvip.com

３８　蒋凤英，等：出口家禽新城疫病毒ＰＣＲ和ＥＩ　ＩＳＡ联合检测方法的建立　２４卷　２．２病毒检测试验　２．２．１　ＥＬＩＳＡ阴阳性临界值的确定依据ＥＬＩＳＡ法用光密度（ｏＤ）值判定阳性方法：样品ＯＤ值＞阴　性平均ＯＤ值加３个标准差作为结果定值的域值，对３　２１６个Ｆ　代尿囊液样品ＯＤ　值进行统计分析，结　果表明阴性样品ＯＤ　如平均值为０．０８，标准差为０．０７，确定ＯＤ　如＞０．３作为临诊样品阳性判断标准。　２．２．２准确性试验用单抗夹心ＥＬＩＳＡ对３　２１６份Ｆ　代尿囊液进行快速检测，同时用ＯＩＥ推荐的传统　方法进行平行试验，阳性样品３８７份，阴性样品２　７８９份，假阳性样品４０份，假阴性样品０份（表１）。　表１新城疫单抗夹心ＥＬＩＳＡ检测结果　Ｔａｂｌｅ　ｌ　ＥＬＩＳＡ　ｏｆ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｏｆ　Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　２．２．３特异性试验用单抗夹心ＥＬＩＳＡ检测已知血凝性为阳性的４株新城疫病毒（Ｆ４８Ｅ８、ＮＤＶ１、　ＮＤＶ２、ＮＤＶ３）、１份血凝性为阴性样品以及常见禽类病毒ＡＩＶ、ＩＢＤＶ、ＩＢＶ、ＤＨＶ，可检测到已知新城疫　病毒Ｆ４８Ｅ８、ＮＤＶ１、ＮＤＶ２、ＮＤＶ３，不能检出血凝性为阴性的样品和常见禽类病毒ＡＩＶ、ＩＢＤＶ、ＩＢＶ、　ＤＨＶ（表２）。　表２特异性试验结果　Ｔａｂｌｅ　２　Ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｓｐｅｃｉｉｃｉｔｆｙ　ｔｅｓｔ　２．２．４重复性试验随机抽取５个阳性样品，用所建立的方法进行重复性试验，重复性试验变异系数在　８％以内（表３），表明该方法稳定性好，变异程度小。　２．３毒力型鉴定　２．３．１准确性试验挑选１１４个Ｆ　代尿囊液样品（其中阳性样品９８个，阴性样品１６个）进行多重ＲＴ．　表４毒力型鉴定准确性试验　Ｔａｂｌｅ　４　Ａｃｃｕｒａｃｙ　ｏｆ　ＮＤＶ　ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　ｔｅｓｔ　ＰＣＲ试验，同时用脑内接种试验（ＩＣＰＩ试验）作平行试验，符合率为９９．１％（表４）。　表３重复性试验结果　Ｔａｂｌｅ　３　Ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｒｅｐｅａｔｅｄ　ｔｓｔｅｓ　样品号　第１次　第２次　第３次　第４次变异系数／％　样品数　检出数　ｓａｍｐｌｅｓ　ｎｕｍｂｅｒ　符合率／％　ｒａｔｅ　￡！！！　ＮＤＶ１　！！　！　２．２２　！帅！．　２．４４　！　！　２．２４　！　！　２．Ｏ６　７．１　Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ　ＩＣＰＩ　Ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ　ＮＤＶ２　ＮＤＶ３　ＮＤＶ４　ＮＤＶ５　２．０（１　２．５２　１　９２　２．３１　２．３０　２．５３　１．９５　２．１７　２．０３　２．４７　１．８６　２．３４　２．０８　２．４８　２．１０　２．２９　６．７　１．２　５．１　３．５　强毒样品Ｖｉｒｕｌｅｎｔ　ｓａｍｐｌｅｓ　弱毒样品Ｌｏｗ　ｖｉｒｕｌｅｎｔ　ｓａｍｐｌｅｓ　阴性样品Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　总计Ｔｏｔａｌ　７　９１　１６　１１４　７　９０　１６　１１３　＞１　６　＜（１．４　—　—　１００　９８．９　１（１（１　９９．１　２．３．２特异性试验用多重ＲＴ．ＰＣＲ检测已知　血凝性为阳性的２株新城疫强毒株（Ｆ４８Ｅ８、２　０００　ＮＤＶ１）、２株新城疫弱毒株（ＮＤＶ２、ＮＤＶ３）、１份　阴性样品、常见禽类病毒ＡＩＶ、ＩＢＤＶ、ＩＢＶ、ＤＨＶ．ｎｎｎ　以及１份ＳＰＦ鸡胚尿囊液，可检测到已知新城疫７５０　病毒Ｆ４８Ｅ８、ＮＤＶ１、ＮＤＶ２、ＮＤＶ３，不能检出阴性样品、ＳＰＦ鸡胚尿囊液样品和常见禽类病毒　ＡＩＶ、１ＢＤＶ、ＩＢＶ、ＤＨＶ（图３）。　ｓ０ｎ　３６２　ｂｐ　２５４ｂｐ　２．３．３　ＲＴ．ＰＣＲ产物鉴定随机选取４个ＮＤＶ　１００　Ｍ：ＤＬ２０００　Ｍａｒｋｅｒ；１：ＡＩＶ；２：ＩＢＤＶ；３：ＩＢＶ；４：ＤＨＶ；　５：Ａ１ｌａｎｔｏｉｃ　ｆｌｕｉｄ　ｆｒｏｍ　ＳＰＦ　ｃｈｉｃｋｅｎ　ｅｍｂｒｙｏ：６：Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｓａｍ—　ｐｉｅ：７　ａｎｄ　８：Ｖｉｒｕｌｅｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ＮＤ—Ｆ４８Ｅｆ；ａｎｄ　ＮＤＶ　１；９　ａｎｄ　１０：ＬＯＷ　ｖｉｒｕｌｅｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ＮＤ—ＮＤＶ２　ａｎｄ　ＮＤＶ３　毒株的ＲＴ．ＰＣＲ产物进行测序，经ＢＬＡＳＴ在线　分析和ＤＮＡＳＩＳ软件分析，与ＧｅｎＢａｎｋ中部分　新城疫病毒Ｆ基因的基因同源性在８１％～１００％　（表５），表明ＰＣＲ扩增产物为预期的目标产物。　图３特异性试验结果　Ｆｉｇ．３　Ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｓｐｅｃｉｉｃｉｔｆｙ　ｔｓｔ　ｅ２．４检测时间统计　新城疫病毒ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ联合检测法需检测时间７　ｄ，传统的病原分离及鉴定方法需检测时间　１４￣２１　ｄ，可缩短检测时间７～１４　ｄＣ表６）。　维普资讯 http://www.cqvip.com ２期　上　海　农　业　学　报　３９　项目名称　Ｉｔｅｍ　传统方法　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ＥＬＢＡ和ＰＣＲ联合检测法　Ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ＥＬＩＳＡ　ａｎｄ　ＰＣＲ　３讨论　本实验室是欧盟认可的出口家禽ＮＤＶ检测实验室，近年来一直承担着上海地区出口家禽ＮＤＶ检　测任务。根据实验室几年来的实践经验以及针对出口家禽ＮＤＶ检测的特点，建立了出口家禽新城疫病　毒ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ联合检测方法。解决了以下几个问题，首先，本方法通过盲传一代，适当扩增了病毒，　提高了检出率，降低出口产品携带病毒的风险；其次，用ＥＬＩＳＡ试验进行快速检测及筛选，减少ＰＣＲ试　验数量，降低了检测成本；最后，用多重ＲＴ．ＰＣＲ试验进行毒力型鉴定，缩短了强弱毒鉴别的时间以及强　毒扩散对环境造成的污染。　病毒增殖试验表明，家禽泄殖腔棉拭样品含病毒量较低，直接用ＥＬＩＳＡ或ＲＴ－ＰＣＲ进行检测，敏感　性比传统的病原分离低，通过一代盲传，可明显提高检出率。　病毒检测试验证明，本方法与病原分离方法的符合率为９８．８％，其敏感性为１００％，特异性为９８．　６％，假阳性率为１．４％，假阴性率为０，且本方法可检测到已知新城疫病毒Ｆ４８Ｅ８、ＮＤＶ１、ＮＤＶ２、ＮＤＶ３，　不与阴性样品和常见禽类病毒ＡＩＶ、ＩＢＤＶ、ＩＢＶ、ＤＨＶ反应，表明本方法敏感性、特异性良好。　从毒力类型鉴定试验中可知，多重ＲＴ．ＰＣＲ和脑内接种试验的符合率为９９．１％，准确性高。且多重　ＲＴ．ＰＣＲ可检测到已知新城疫病毒Ｆ４８Ｅ８、ＮＤＶ１、ＮＤＶ２、ＮＤＶ３，不与阴性样品、ＳＰＦ鸡胚尿囊液样品　和常见禽类病毒ＡＩＶ、ＩＢＤＶ、ＩＢＶ、ＤＨＶ反应，具有良好的特异性。挑选４个ＮＤＶ毒株的ＲＴ．ＰＣＲ产　物进行测序，经ＢＬＡＳＴ在线分析和ＤＮＡＳＩＳ软件分析，与ＧｅｎＢａｎｋ中部分ＮＤＶ　Ｆ基因的同源性在　８１％～１００％，验证了多重ＲＴ．ＰＣＲ扩增的高度特异性，表明用多重ＲＴ－ＰＣＲ进行ＮＤＶ毒力类型鉴定方　法是准确的、特异的。经检测时间统计，发现ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ联合检测法比传统方法缩短检测时间７～１４　ｄ，为适当推迟采样时间，减少采样后至上市间重新感染新城疫病毒的概率提供了可能，从而减少了假阴　性样品，降低出口风险系数，具有实用性。经实践证明，用ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ联合检测方法，检测出口家禽　泄殖腔棉拭样品中ＮＤＶ，具有实用、快速、敏感、特异等特点，能满足出口检测需要，应用前景广阔。　参考文　献　［１］Ｏｆｆｉｃｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｄｅｓ　Ｅｐｉｚｏｏｔｉｅｓ．Ｌｉｓｔ　Ａ　ａｎｄ　Ｂ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｏｆ　Ｍａｍｍａｌｓ，Ｂｉｒｄｓ　ａｎｄ　Ｂｅｅｓ：Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　ｆｏｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｔｅｓｔｓ　ａｎｄ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ．５ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ［－Ｍ］．Ｐａｒｉｓ：Ｏｆｆｉｃｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｄｅｓ　Ｅｐｉｚｏｏｔｉｅｓ，２００４．　［２］陈丽颖，王亚宾，张红英，等．幼鸽暴发新城疫及其对人感染报告［Ｊ］．中国人兽共患病杂志，１９９９，１６（５）：１１３—１１７．　［３］张鹤晓，赖平安，高志强，等．荧光ＲＴ．ＰＣＲ检测活禽和禽产品中新城疫病毒中强毒株的研究［Ｊ］．中国兽医杂志，２００６．４２（３）：３—６．　［４］唐小飞，谢芝勋，刘加波，等．多重ＲＴ－ＰＣＲ快速检测鉴别新城疫病毒强毒株和弱毒疫苗株方法的建立［Ｊ］．中国兽医科技，２００５，３５　（１１）：８８８—８９１．　５］Ｍａｌｉｋ　Ｙ　Ｓ，Ｐａｔｎａｙａｋ　Ｄ　Ｐ，Ｇｏｙａｌ　Ｓ　Ｍ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ａｖａｉｎ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｂｙ　ｓｉｎｇｌｅ－ｔｕｂｅ　ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｐｏｌ－　ｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ａｓｓａｙＥＪ］．Ｊ　Ｖｅｔ　Ｄｉａｇｎ　Ｉｎｖｅｓｔ，２００４，１６（３）：２４４—２４８．　［６］Ｓｏａｒｅｓａ　Ｐ　Ｂ　Ｍ，Ｄｅｍｅｔｒｉｏａ　Ｃ，Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏａ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｄｕｐｌｅｘ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ａ　ａｎｄ　Ｎｅｗ－　ｃａｓｔｌｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｉｎ　ｍｉｇｒａｔｏｒｙ　ｂｉｒｄｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００５，１２３：１２５—１３０．　［７］国际兽医局．诊断试验和疫苗标准手册［Ｍ］．青岛：农业部畜牧兽医局，２００４．　［８］吴红专，张如宽，刘秀梵．新城疫单抗ＥＬＩＳＡ试剂盒的研制及其初步应用［Ｊ］．中国兽医科技，１９９５，２５（６）：３—６．　［９］Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ　Ｅ　Ｆ，Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｌｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　ｅｄ［Ｍ］．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ－　ｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９．　［１０］国际兽医局．诊断试验和疫苗标准手册［Ｍ］．青岛：农业部畜牧兽医局，１９９６．