乙型肝炎病毒表面抗原检测试剂盒（胶体金法）生产工艺研究
及反应体系的建立研究资料
乙型肝炎病毒表面抗原检测试剂盒(胶体金法) 生产工艺研究及反应体系的建立研究资料
目录
A、研究择要--------------------------------------------------------------------------------------------------第2页
B、缩略语------------------------------------------------------------------------------------------------------第5页
C、正文
一、.主要生产工艺描述及确定依据---------------------------------------------------------------第6页
二、反应体系的组成----------------------------------------------------------------------------------第16页
三、被测样本的要求----------------------------------------------------------------------------------第17页
四、试剂用量--------------------------------------------------------------------------------------------第19页
五、体系的反应条件---------------------------------------------------------------------------------第20页
六、体系的有效性确定方法(校准、质控方法) ---------------------------------------------第21页附图1 乙型肝炎病毒表面抗原检测试剂盒（胶体金法）生产工艺流程图---------------第23 页
A、研究择要
本检测试纸是由固相有纯化的高特异性鼠抗HBsAg单克隆抗体A(检测线)和羊抗鼠IgG多克隆抗体(对照线)的纤维素膜、吸附有胶体金标记抗HBsAg单克隆抗体B的无纺布膜、玻璃纤维、吸水纸等其它辅料因此粘贴制成，用于定性的检测人血清/血浆中乙型肝炎病毒表面抗原。
当进行检测时，若为阳性标本，样本中的HBsAg与金标记的抗HBsAg抗体B结合形成复合物，此复合物由于层析作用沿试纸条向前移动，则与检测线区固相的抗HBs抗体A形成“固相抗HBsAg抗体A -HBsAg-金标记抗HBsAg抗体B”双抗体夹心复合物而凝聚显色；若为阴性标本，在检测线区域不能形成双抗体夹心复合物，因此不显色。
无论HBsAg是否存在于测试样本中，一条有色条带都会出现在对照线区内。对照线区内所显现的有色条带是判定是否有足够标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。若无对照线出现，则实验无效。
通过对样本用量、试剂用量、反应温度、质控方法等研究，建立制造工艺和质控方法，确定本检测试纸的操作步骤、结果判定以及注意事项等，最终建立生产工艺和反应体系。
B、缩略语 编号名词缩略语
1 乙型肝炎病毒五项标志物HBV 2 乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg 3 鼠抗HBs单克隆抗体鼠抗HBs抗体 4 羊抗鼠IgG多克隆抗体GAM C、正文
1、主要生产工艺过程 1.1金标抗体反应膜制备 1.1.1参数设置 表1 胶体金标记参数
A104 胶体金－CG(单位：μg/ml)
A103 最适OD值配对宽度（mm）原料名称最适标记量 0.8％鼠抗HBsAg单克隆抗体B (Y－002/ HBsAg) 15 0.4% 35 7.5±1 1.1.2金标反应膜制备 表2 金标反应膜清单
物料编码辅料名称规格批配料量（1000板）F-002-3 无纺布38cm×27cm30张
Y-002/ HBsAg 鼠抗HBsAg单克隆抗体B / 120mg 注：(1)Y-002/ HBsAg的包装规格可以不同，但是总量一定。
(2) 此规格每张有效长度均以34cm计，折合34板(每板宽度1cm)。 1.1.
2.1胶体金溶液制备
在加热煮沸的3800ml纯化水中快速加入A102溶液80ml，待溶液再次沸腾后，迅速加入A101溶液80ml，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，计时继续加热10分钟即可。待溶液冷却至室温后，加入纯化水补充至4000ml。共制备2瓶。
备注：每1000板需要该比例胶体金溶液的体积为8000毫升。 1.1.
2.2胶体金-抗体结合物制备：
标记原料：鼠抗HBs 单克隆抗体B (Y-002/ HBsAg)
每4000ml胶体金溶液，首先加入32ml A104，混匀，将上述胶体金溶液按照15μg/ml 的比例加入Y-002/ HBsAg (即每1000ml需要Y-002/ HBsAg的重量为15mg)，混匀，静置5分钟，然后加入A103溶液16ml，混匀，静置5分钟。经3次30分钟的离心，离心速度为：5000rpm、7000rpm、9000rpm，合并三次收集的沉淀(体积V
1 )。 1.1.
2.3金标反应膜制备 合并沉淀体积为V 1
，取30ul沉淀100倍稀释测524nmOD值A(A>0.5)，按 100A*V 1=35*V
2
加金标结合物稀释液稀释沉淀至体积V 2
即制得金标抗体溶液；将制得的
金标抗体溶液按每张无纺布涂布10ml均匀涂布，室温晾干18－20小时即可。
1.1. 2.4分切
将晾干的金标反应膜按照中间体配对确定的宽度进行分切(通常7.5±1 mm)，记做生产中间体条组分S4。铝箔袋密封，室温存放。
1.2纤维反应膜制备 表3 包被参数
检测线－T(单位：mg/ml) 对照线－C(单位：mg/ml) 原料名称稀释浓度原料名称稀释浓度 鼠抗HBsAg单克隆抗体A Y－001/ HBsAg 1.5
羊抗鼠IgG多克隆抗体 Y－003/GAM
1.0 表4 纤维素膜固相准备
物料编码辅料名称规格批配料量（1000板）F-001-3 纤维膜27cm×16cm125张
HBsAg 01 HBsAg 01包被液 1.5mg/ml 60mg
HBsAg 03 HBsAg 03包被液 1.0mg/ml 40mg 注：(1) 每ml包被液可以包被25板；每1000板需要40ml包被液；
(2) 每张纤维膜计为8板；
(3) 纤维反应膜沿膜上密虚线标志线分切。 1.2.1包被
(1) 抗HBs单克隆抗体A(检测线)、羊抗鼠lgG多克隆抗体(对照线)使用B101分别稀释至1.5mg/ml、1.0mg/ml，分别加入喷点包被机的1号杯、2号杯；
(2) 调试自动喷膜机，喷液量设定为1.4μl/cm，导轨速度6.0cm/sec。喷嘴1与2间隔5mm.。
(3)包被后的纤维素膜过夜晾干。 1.2.2封闭
(1) 按每100ml B102+900ml纯化水浸泡5张（折40板）膜计，将包被好的膜浸入封闭2小时；
(2) 将膜取出沥干，过夜晾干，即制得纤维反应膜，存干燥盒转入中间站待验，待检合格后沿膜上密虚线标志线分切。
1.2.3 分切
按照膜面标志线分切，每张8板。记做生产中间体条组分S1。铝箔袋密封，室温存放。
2、建立的反应体系 2.1样本要求
1) 样本采集前对受检者无特殊要求，不需禁食，按照常规的实验室程序收集血清/血浆标本。
2) 样本收集后应尽快分离血清/血浆以避免融血。严重溶血和乳糜样本不能用于检测，以免引起误判；已经进行加热处理的样本及已被微生物污染的样本不能用于检测。
3) 血清样本应收集在不含任何抗凝剂的试管中，血浆样本应收集于含有正常使用量柠檬酸钠、肝素、EDTA等抗凝剂的容器中。如果需要，样本中可加入0.1%叠氮钠作为防腐剂。
4) 样本收集后应尽快检测，不能将样本在室温放置太长的时间。如果收集的当天不使用，应当冷藏2-8℃保存，超过7天应当冷冻于-20 ℃保存。应尽量避免反复冻融，使用前不得超过2-3次。
5) 检测前应将样本恢复至室温，冷冻的样本应等完全融化后方可使用。
2.2检验方法
检测试剂、待检样品和其它检测用材料等测试前需平衡至室温： 1) 打开铝箔袋，取出检测试剂。
2) 试条：持试条将有箭头标志线一端插入样本收集容器中，确保
样本液面直到标记线且浸没时间至少10秒(注：深度不可超过标志线横线)，然后取出平放或粘切在测试卡(可用记录纸代替)；或者直接在试纸条/板样品垫端加样处滴1-2滴(60-80μl)待测样本，开始计时观察测试结果；
试盒：用塑料滴管在试剂盒加样区中心缓慢滴加2-3滴血清或血浆样本（约60-100μl，开始计时观察测试结果。
3) 等待红线出现，应在10-20分钟时观察反应结果，30分钟结果判定无效。
2.3检验结果的解释
1) 阳性结果：出现两条红色条带，一条位于检测线区内，另一条位于对照线区内。表明测试样本中检出乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)；
2) 阴性结果：仅出现一条红色条带，即对照线区内出现红色条带，检测线区内无有色条带出现。表明测试样本中未检出乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)；
3) 无效结果：当对照线区内未出现有色条带，表明试验失败或试剂失效，需进行重复检测。
一、主要生产工艺描述(固相载体、显色系统、指示系统等) 及确定依据； 1主要材料 (1) 主要原料
鼠抗HBsAg单克隆抗体A(包被检测线) 鼠抗HBsAg单克隆抗体B(胶体金标记) (2) 辅料
纤维素膜、吸水纸、玻璃纤维、无纺布、箭头胶、双面胶带、塑料基板、(3) 化学试剂
Tris、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、BSA、EDTA、Tween-20、抗体稀释液；氯金酸、柠檬酸三钠、PH调节剂、胶体金标记物稳定液
(4)测试样本
包括本公司自己制定的内质控参考品、中国药品生物制品检定所提供的HBsAg酶标类国家标准品。
按照各自的说明书进行使用和结果判断。 2实验仪器:
自动喷膜机美国BIO-DOT公司 XYZ3050 封口机温州兄弟 SF-150 切条机 Kinematic Matrix2360 高速冷冻离心机 BECKMAN J2-MC 紫外分光光度仪 Helios Gramma 电子分析天平 Sartorius BS210S 生物安全柜上海瑞仰 BSCⅡB-1101 压力灭菌器上海博迅 YXQ-LS-18SI
微量加样、刻度吸管、酶标板、纯水机等。 3操作
3.1固相纤维素膜 3.1.1对照线喷液量的选择
将纯化好的羊抗鼠IgG多克隆抗体稀释到浓度为1mg/ml，用自动喷膜机喷涂质控线，喷膜量分别为 1.6μl/cm、1.4μl/cm、1.2μl/cm，比较用不同喷膜量所得的划线效果。结果表明1.4μl/cm喷膜量时所划线边缘整齐，线条精细。
3.1.2 纤维素膜检测线与对照线抗体的包被
当喷膜量为1.4μl/c m，将抗HBs单克隆抗体A稀释稀释至1mg/ml，对照线羊抗鼠IgG抗体稀释至1mg/ml，分别包被纤维素膜的检测线与对照线。室温干燥过夜，37℃封闭4h。储存备用。
3.2胶体金—抗体结合条件选择 3.2.1 胶体金溶液的制备
该产品使用的胶体金是柠檬酸三钠还原法制备的，具体方法如下： 1) 加热一份100毫升纯化水，煮沸后快速加入2.0ml 胶体金氧化剂；
2) 再加入2.0 ml的胶体金还原剂，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，继续煮沸10min，停止加热,室温冷却。
3) 将冷却后的胶体金溶液补水至100 ml，使用紫外扫描检定，进行400-600nm紫外扫描，确定最大吸收峰波长，观察最大吸收峰的峰型和峰宽。
表1 胶体金一览表
A102（ml）A101（ml）颜色最大吸收波长(nm) 2 2 酒红524
3.2.2 鼠抗HBs单克隆抗体B与胶体金结合pH范围确定 1) 取9个1ml离心管，每管加入1ml 2:2的胶体金溶液； 2) 每管分别加入pH调节剂0μl、2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、12μl、14μl、16μl；
