诱导HO-1表达对慢性间歇性缺氧下INS-1细胞凋亡的影响

诱导HO-1表达对慢性间歇性缺氧下INS-1细胞凋亡的影响

徐健李小莉李一禄陈济明

【摘要】目的了解诱导HO-1表达对慢性间歇性缺氧下INS-1细胞凋亡的影响。方法通过不同浓 度CoPP作用于慢性间歇性缺氧下INS-1细胞，观察胰岛素水平、HO-1及Caspase-3水平，采用RT-PCR检测

H0-l、Caspase-3mRNA表达。结果随着CoPP浓度增高，胰岛素、H0-1表达逐渐增高，而Caspase-3逐渐降

低，而CoPP浓度达到40umol/L时作用最强（P<0.05)。结论慢性间歇性缺氧下诱导INS-1细胞H0-1表 达，抑制凋亡相关蛋白CaSpase-3,在一定程度上对细胞起保护作用。

【关键词】慢性间歇性缺氧;INS-1 ;H0-1;凋亡;Caspase-3

Effect of induced HO-1 expression on INS-1 cells in chronic intermittent hypoxia XU Jian, LI Xiao-li, LI Yi-

lu, CHEN Ji-ming Department of Respiratory Medicine, Shenzhen Nanshan District People，s Hospital, Shenzhen 518052, China【

Abstract】 Objective To understand the effect of HO-1 expression on the apoptosis of INS-1 cells induced

by chronic intermittent hypoxia. Methods INS-1 cells were observed under different concentrations of CoPP in chro­nic intermittent hypoxia, and the levels of insulin were observed. It used RT-PCR to detect the expression of HO-1 and Caspase-3 mRNA. Results

With the increase of CoPP concentration, the expression of insulin and HO-1 mR-

The induced expression of HO-1 in INS-1 cells can inhibit protein

NA gradually increased, while Caspase-3 mRNA decreased. When the concentration of CoPP reached 40umol/L, the strongest effect was observed. Conclusion Caspase-3, and protected the cells at certain extent.

[Keywords] chronic intermittent hypoxia; INS-1; HO-1; apoptosis; Caspase-3

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（OSAHS) 以睡眠中反复发作的呼吸暂停或上气道梗阻为特 征，常常与打鼾、睡眠中断、白天嗜睡和血氧饱和度

降低相关[1]。研究证实，0SAHS引起的睡眠结构紊 乱和间歇性低氧，能诱发氧化应激、炎症反应，激活 交感神经系统，损伤血管内皮功能m。研究还发 现，0SAHS是于肥胖的代谢综合征的危险因 素[8]。0SAHS与糖尿病之间关系越来越受到重视， 但具体机制尚不完全清楚。已有研究发现，胰岛细 胞凋亡在糖尿病发生发展是重要机制之一。H0-1 系统是机体重要的内源性保护系统，主要通过抗炎， 抗氧化、抗凋亡等机制起作用[^11]。我们探讨在间 歇性缺氧条件下通过CoPP诱导INS-1胰岛细胞

H0-1表达，对INS-1胰岛细胞凋亡的影响。

资料与方法

胰岛P细胞株INS-1 (上海拜力生物科技有限 公司）；牛血清白蛋白（Sigma);细胞培养试剂、胎牛 血清、RPMI 1〇 培养基（均为 Gibco)。CoPP (Sig­

ma) 。

二、方法

1

细胞培养:胰岛INS-1细胞株购买后，用含

10%新生牛血清，2mmol/LL-谷氨酰胺，lmmol/L丙 酮酸钠，50mm〇iyL -巯基乙醇，1 xio5 IU/L青霉 素和lOOmg/L链霉素的RPMI10培养基，在 37°C，5% C02及饱和湿度的恒温箱中培养，每2 - 3d传代一■次。

2

研究对象共分为六组：将密度为1 xlO5/

mL的INS-1细胞悬液接种至96孔培养板，每组6

个复孔，培养箱中培养24h后，置于自制密闭仓中， 暴露时以缺氧（1. 5 % 0 2)气流洗脱细胞培养中气 体，继而维持缺氧状态时间（即IH时段），再以正常 氧(21% 02)气体洗脱缺氧气体，而后再维持正常 氧时间，周而复始形成循环。IH暴露时间为12h， 次数均为15次/h。细胞暴露的同时，分别加入不同 浓度的 CoPP(0、10、20、40、60、80)um〇l/L，12h 后收 集细胞及上清液进行相应检测。

一、实验材料

doi：10.3969/j.issn. 1009 -6663.2017.07.023

基金项目：广东省科技计划项目（N〇 2(U3B021800048)

作者单位:518000广东深圳，深圳市南山区人民医院呼吸内科

1242临床肺科杂志2017年7月第22卷第7期

3细胞胰岛素分泌检测：将细胞按5 * 104

A

研究发现随7

f CoPP浓

度增加，

到

H0-I农

H0

达叨显 ，

个/孔培养于24孔板，暴露结朿衍，收集细胞上清 液，采顏放射免疫分析法（试剂盒购于北京科义牛 物技术有限公司）测记胰岛素水平。

4 RT-PCR 检测 HO-1 和 Caspase-3 mRNA _ 达;羅用TRIzol抽提细胞总RNA，按照标准抽提步 骤进行RNA抽提;取样品1 ug，逆转氽为cDNA，采 用PCR设计和评估软件Primer 3. 0设计实时PCR 引物。引物序列：H0-1上游引物：ACAGAAGAG-

升高*虽剤量依耐性，

CoPP达4〇Umol/L时H0-1

达达到顶峰（P<〇.〇5)。而后随着

-1浓度增

加，

HO-lmRNA表

达人见继续增高。（见图

2)q

GCTAAGACCG;:下游引物：CAGGCATCTCCTTC- CATT。Caspase-3

游引物：CATGGAAGCGAAT-

CAATGGACT;下游引物：CTGTACCAGACCGAGAT- GTCA。取样本总CDNA24、上下游_物各lmL，按

照试剂盒说明书配制相应反应参数的反应体系。 PCR扩增条件94°C预变性2min; 95丈变件1 min， 60°C退火20s，72°C延伸30s，共45个循环。运用数 据分析软件进行分析，采用2 _AA&法汁：T):，得到相 对值《

三、统计分析

采用SPSS 16.0统计软件进行方差分析，数据 以％ ± .s及/j-Vff先行方左齐性检验，然后再迸行两 两比较，'4 P < 〇. 05时差统汁于总义。

结

果

一

、诱导H0-1表达对INS-1胁岛尜分泌影响

研究发现随着CoPP浓度增加，胰岛素水平逐 渐升当CoPP达到4〇Umol/L时，INS-1细胞胰岛 素水平最< 〇. 05 )，以P随矜浓度增加胰岛素 水平逐渐下降

〇

(见图

图1不同浓度CoPP对INS-1胰岛素分泌影响

二、诱

导

H0-1农

达对

INS-

1细胞

HO-lmRNA

的影响

图2不同浓度CoPP对INS-1细胞HO-lmRNA表达的影响

三、诱导

H0

-1表达对

INS-

1细胞

Caspase-3

mRNA的影响

研究发现随着

CoPP浓度增加，Caspase-3

mR­

NA 表

达明 显降低 。，当

CoPP 达到

4〇Umol/L 时

，能

最大程度抑制Caspase-3 mRNA表达

（

P < 0. 05 ) d

(见图3

)a

图3不同浓度CoPP对INS-1细胞Caspase-3 mRNA表达的影响

讨 论

近年来，随着研究深人发现0

SAHS作

为一种常

见病，影响全身多个系统，目前认为是一种源头性疾

病，导致严审

Xi•果。

研究发现，0

SAHS与

糖尿病、冠

公病、A丨仳压、心律失常以及缺血性脑

I〖ILim

病存作 内在联系[12_14]。多项研究士叨，0SAHS与

糖尿病

存伯丨以丨丨又

fk。M时

，随着中国版0

SAHI与

糖尿

临床肺科杂志2017年7月第22卷第7期1243

病专家共识的发布，大家越来越关注此两种疾病。

慢性间歇性缺氧是OSAHS主要的致病机制之 一，而胰岛素分泌不足和胰岛细胞凋亡增加也是糖 尿病重要的发病机制。研究发现，慢性间歇性缺氧 可引起胰岛素抵抗，加重大鼠胰岛细胞凋亡[15]，因 此，凋亡可能是OSAHS与糖尿病内在关联纽带。同 时，我们前期研究已证实，慢性间歇性缺氧能明显抑 制INS-1胰岛素水平和诱导凋亡。

HO-1是血红素降解途径限速酶，具有抗炎、抗

Physiol,2014,307(2) ：L129 -L140.

[4]

Gileles-Hillel A, Almendros I,Khalyfa A,et al. Early intermittent hypoxia induces proatherogenic changes in aortic wall macrophages in a murine model of obstructive sleep apnea[ J]. Am J Respir Crit Care Med ,2014,190 (8) ：958 -961.

[5 ]

Nair D, Zhang SX, Ramesh V, et al. Sleep fragmentation induces cognitive deficits via nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-dependent pathways in mouse [J]. Am J Respir Crit Care Med,2011,184(11) ：1305 -1312.

[6]

Carreras A, Zhang SX, Peris E,et al. Chronic sleep fragmentation induces endothelial dysfunction and structural vascular changes in 凋亡、抗增殖等多种生物学效应。现有的证据显示， 诱导胰岛HO-1表达，能对抗细胞因子介导的有害 影响。钴原卟啉（CoPP)，作为HO-1的底物，能增加

H0-1的表达和活性。而有关H0-1与凋亡的研究

中发现，H0-1可通过抑制Caspase-3表达起到抗凋 亡作用[16]。CaSpaSe-3是含半胱氨酸的天冬氨酸特 异水解酶，在细胞凋亡早期及凋亡过程中起重要作 用，是细胞凋亡的关键酶。在正常情况下以无活性 的酶原形式存在于多种细胞胞质中，多种刺激因素 可激活Caspase-3,活化的Caspase-3又进一步切割 不同的底物，引起蛋白级联切割放大，最终使细胞凋 亡[17]。

以往的研究表明，CoPP具有细胞保护作用，主 要通过上调H0-1抑制凋亡相关蛋白capase-3表 达[18]。Lundvig等人研究也发现，诱导H0-1表达能 抑制高剂量姜黄素诱导的角质细胞凋亡[19]。本研 究从体外细胞培养发现，CoPP能促进间歇性缺氧情 况下INS-1细胞胰岛素分泌，抑制凋亡相关蛋白

caspase-3

加，在一定范围内作用越明显，当CoPP达到 40um〇l/L时，其作用最明显。过度诱导H0-1表达 则会因诱导剂的过量而产生毒性作用，使H0-1的 表达减少，损害脏器功能[2°]。因此，诱导H0-1表达 通过抑制Caspase-1减轻INS-1凋亡。

综上所述，CoPP对间歇性缺氧影响下INS-1保 护作用可能与诱导H0-1表达，抑制凋亡有关。

参考文献

[1 ]

Thorpy MJ. Classification of sleep disorders [ J ]. Neurotherapeu­tics,2012,9(4) ：687 -701.

[2]

Zhang SX,Wang Y,Gozal D. Pathological consequences of inter­mittent hypoxia in the central nervous system[ J]. Compr Physiol, 2012,2(3) ：1767 -1777.

[3]

Almendros I, Wang Y,Gozal D. The polymorphic and contradictory aspects of intermittent hypoxia [ J ]. Am J Physiol Lung Cell Mol

mice[J]. Sleep,2014,37(11) ：1817 -1824.

[7]

Zhang SX，Khalyfa A，Wang Y，et al. Sleep fragmentation promotes NADPH oxidase 2-mediated adipose tissue inflammation leading to insulin resistance in mice[ J]. Int J Obes ( Lond) , 2014,38(4)： 619 -624.

[8 ]

Qian Y,Xu H, Wang Y,et al. Obstructive sleep apnea predicts risk of metabolic syndrome independently of obesity ： a meta-analysis [J], Arch Med Sci,2016,12(5 )： 1077 - 1087.

[9]

Wang P,Qiao Q,Li J,et al. Inhibitory effects of geraniin on LPS- induced inflammation via regulating NF-kappaB and Nrf2 path­ways in RAW 2. 7 cells[ J]. Chem Biol Interact ,2016,253 ： 134 -142.

[10] Dai C, Li B,Zhou Y,et al. Curcumin attenuates quinocetone in­

duced apoptosis and inflammation via the opposite modulation of Nrf2/HO-l and NF-kB pathway in human hepatocyte L02 cells [J]. Food Chem Toxicol,2016 ,95 ：52 -63.

[11] Xie L,Gu Y, Wen M,et al. Hydrogen Sulfide Induces Keapl S-sul-

fhydration and Suppresses Diabetes-Accelerated Atherosclerosis via Nr£2 Activation[ J]. Diabetes ,2016 ,65 (10) ：3171 - 3184.

[12] Westlake K,Plihalova A,Pretl M,et al. Screening for obstructive

sleep apnea syndrome in patients with type 2 diabetes mellitus ： a prospective study on sensitivity of Berlin and STOP-Bang question­naires [J] .Sleep Med ,2016,26 ：71 - 76.

[13 ] Otero L, Hidalgo P, Gonzalez R, et al. Association of Cardiovascular

Disease and Sleep Apnea at Different Altitudes[ J]. High Alt Med Biol,2016,17(4) ：336 -341.

[14] Wang L,Cai A,Zhang J,et al. Association of obstructive sleep ap­

nea plus hypertension and prevalent cardiovascular diseases ： A cross-sectional study[ J] • Medicine ( Baltimore) , 2016,95 ( 39 )： e4691.

[15] Fang Y, Zhang Q, Tan J,et al. Intermittent hypoxia-induced rat

pancreatic beta-cell apoptosis and protective effects of antioxidant intervention[ J]. Nutr Diabetes ,2014 ,4 ：el31.

[16 ] Li C, Zhang C, Wang T, et al. Heme oxygenase 1 induction protects

myocardiac cells against hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis :The role of JNK/c-Jun/Caspase-3 inhibition and Akt signaling enhancement[ J]. Herz ,2016 ,41 (8) ：715 - 724.

[17 ] Sun J, Xie C , Liu W, et al. The effects of simvastatin on hippocam­

pal caspase-3 and Bcl-2 expression following kainate-induced sei­zures in rats[ J]. Int J Mol Med ,2012 ,30(4) ：739 - 746.

1244临床肺科杂志2017年7月第22卷第7期

门诊哮喘患儿近4年哮喘控制情况的调查分析

张建平1

冯志冠2

鲍燕敏2

郑跃杰2

【摘要】目的了解近4年来门诊随诊哮喘患儿的疾病控制情况，并探讨影响控制水平的因素。方法 2012年及2016年两次在深圳市儿童医院呼吸专科随诊的4 - 18岁的哮喘患儿进行C - ACT或ACT面对 面的调查问卷，比较2012年144例和2016年的145例的哮喘控制水平。结果2016年调查哮喘患儿的良好 控制率(部分控制率+完全控制率）（91.0%)高于2012年的良好控制率（66. 7%),有统计学意义（P < 0. 05) ;2016年近期使用吸人型糖皮质激素治疗组的良好控制率(96. 1% )高于未使用吸人型糖皮质激素治疗 组(79. 1% ),有统计学意义(P <0. 05) ;2016年哮喘合并过敏性鼻炎组的良好控制率(87. 9% )低于哮喘未合 并过敏性鼻炎组（100% ),但无统计学意义(P >〇. 05)。结论近四年我院门诊哮喘患儿的良好控制率有明 显提局。

【关键词】哮喘;儿童;哮喘控制

Assessment of asthma control of children with asthma in outpatient in recent 4 years

519041, China【

ZHANG Jian-ping,

FENG Zhi-guan, BAO Yan-min, ZHENG Yue-jie Zhuhai Campus of Zunyi Medical University, Zhuhai, Guangdong

Abstract】 Objective To evaluate the level of asthma control among asthmatic children in outpatient in re­

cent 4 years and to explore the factors of asthma control. Methods Face-to-face questionnaire investigation was con­ducted among 4-18 years old asthma outpatients in Shenzhen childrens hospital with C-ACT or ACT, and the results were compared with 144 cases in 2012 and 126 cases in 2016 of asthma control. Results

The well controlled asth­

ma rate in survey in 2016 (91. 0% ) was significantly higher than that in 2012 (66. 7% )，and there was statistical significance (P <0. 05). The well controlled asthma rate in the inhaled corticosteroid ( ICS) group (96. 1 % ) was higher than that in the without ICS group (76. 4%) in 2016 survey ( P < 0. 05 ). The well controlled asthma rate in the combined allergic rhinitis group (87. 9% ) was lower than that in the uncombined allergic rhinitis group (100% ) in 2016 survey ( P > 0. 05 ) . Conclusion recent 4 years.

The well controlled asthma rate is significantly improved in our hospital in

【Key words 】 asthma; children; asthma control

支气管哮喘是一种以反复发作的咳嗽、喘息、胸 闷及呼吸困难为表现的慢性气道炎症性疾病。近年 来据国内可靠的流行病学调查显示我国的儿童支气

管哮喘发病率有明显上升趋势，全国城市14岁以下 哮喘儿童的患病率由2000年的1. 97%增至2010年

doi： 10. 3969/j. issn. 1009 - 6663.2017. 07.024

的3. 02%，严重影响了患儿的生命质量和家庭幸福 感[1 _2]。尽管哮喘尚不能根治，但根据全球多中心 临床研究中心GOAL显示，近50%患者可达到完全 控制，近80%患者可达到良好控制[3]。为了 了解我 院近4年门诊哮喘患儿良好控制水平是否提尚，为 此我们比较了 2012年及2016年两次在深圳市儿童 医院呼吸专科就诊的哮喘患儿哮喘控制的情况，并 探讨影响控制水平的相关因素。

作者单位:1. 519041广东珠海,遵义医学院珠海校区

2. 518000广东深圳，深圳市儿童医院呼吸科

通信作者:郑跃杰，E-mail: yuejiez@ sina. com

[18 ] Ma T, Chen T, Li P, et al. Heme oxygenase-1 ( HO-1) protects hu­

man lens epithelial cells ( SRA01/04) against hydrogen peroxide (H2 02 ) -induced oxidative stress and apoptosis [ J ]. Exp Eye Res, 2016,146：318 -329.

[19] Lundvig DM,Pennings SW,Brouwer K M,et al. Cytoprotective re­

sponses in HaCaT keratinocytes exposed to high doses of curcumin

[J], Exp Cell Res,2015,336(2) ：298 -307.

[20]刘明，赵晓宇，王波，等.钴-原卟啉诱导大鼠血红素加氧酶-

1适度过表达的研究[J].医学分子生物学杂志，2005,2(2): 79 -82.

[收稿曰期：2016 -11 -10]