HPLC-TOF-MS分析泽泻提取物中三萜类化合物
邓岳;刘阿娜;王小明;周洪雷;李运伦;蒋海强
【摘 要】分析和鉴定泽泻提取物中的化学成分.采用高效液相色谱与飞行时间质谱联用技术(HPLC-TOF-MS),在正离子检测模式下用全扫描方式获得高分辨质谱数据,结合Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis软件、PCDL、数据库和参考文献,总结已知化学成分的质谱裂解规律,对泽泻中的三萜类成分进行定性鉴别.泽泻提取物鉴定了22种三萜化合物.实验结果为泽泻的物质基础及质量控制研究提供了理论依据.
【期刊名称】《化学分析计量》 【年(卷),期】2015(024)006 【总页数】4页(P11-14)
【关键词】泽泻;三萜类;化学成分;高效液相色谱与飞行时间质谱联用技术 【作 者】邓岳;刘阿娜;王小明;周洪雷;李运伦;蒋海强
【作者单位】山东中医药大学,济南250355;山东中医药大学,济南250355;山东中医药大学,济南250355;山东中医药大学,济南250355;山东中医药大学附属医院高血压病中医临床研究中心,济南250011;山东中医药大学实验中心,济南250355 【正文语种】中 文 【中图分类】O657.7
泽泻为泽泻科植物泽泻[Alisma orientalis (Sam.) Juzep.]的干燥块茎，性寒味甘，具有利水渗湿、泄热的功效，可用于小便不利、水肿胀满、痰饮眩晕、高脂血等症
［1］。现代研究表明其具有利尿［2］、降血脂［3］、抗氧化、保肝［4］的作用。三萜类化合物是泽泻的主要化学成分，如泽泻醇A(alisol A)及其衍生物24-乙酰泽泻醇A等，具有一系列药理活性［5-7］。高效液相色谱与飞行时间质谱联用(HPLC-TOF-MS)法分辨能力强，在全扫描的模式下可保证微量成分不被遗失，从而获得大量、有效的化合物结构鉴定信息，是一种快速有效的化合物鉴定方法［8-9］。
目前对泽泻整体药效机制评价与总体药物化学成分研究较多，但采用HPLC-TOF-MS法对其中的三萜类化合物的系统研究尚不多见。因此为了进一步明确泽泻的药效物质基础，笔者对泽泻的有效成分进行了提取，采用HPLC-TOF-MS法对泽泻提取物中的三萜类化合物进行全面系统的定性鉴定，建立药材质谱指纹图谱，为泽泻的综合利用开发提供理论参考。 1.1 主要仪器与试剂
高效液相色谱-飞行时间质谱仪：Agilent 1260 LC-6230 TOF-MS型，美捷司；
纯水系统：Milli-Q型，美国Millipore公司； 分析天平：CP225D型，德国SARTORIUS公司； 泽泻药材：泽泻的干燥块茎；
24-乙酰泽泻醇A对照品：批号18674-16-3，20 mg／支，纯度不小于98%，色谱纯，北京宝赛希望生物科技有限公司；
23-乙酰泽泻醇B对照品：批号26575-95-1，20 mg／支，纯度不小于98%，北京宝赛希望生物科技有限公司；
乙腈、甲醇：色谱纯，德国Merck公司； 甲酸：色谱纯，美国Fisher公司； 实验用水为超纯水；
实验用其它试剂均为分析纯。 1.2 对照品溶液的制备
取24-乙酰泽泻醇A及23-乙酰泽泻醇B对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，定容至25 mL容量瓶中，稀释至所需浓度，经0.45 μm微孔滤膜过滤后备用。 1.3 供试品溶液的制备
将干燥的泽泻药材1.0 kg粉碎，过3号筛。每次准确称取泽泻粗颗粒500 g，加入以10倍药材量的95%乙醇加热回流提取3次，每次1.0 h，合并提取液，回收乙醇。药渣再以10倍量的水加热回流提取3次，每次1 h，合并提取液，蒸发水分。合并提取物并浓缩为浸膏(每mL含有1 g泽泻生药)。将药材浸膏用甲醇溶解、稀释，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得浓度为50 mg／mL的泽泻供试品溶液。 1.4 色谱条件
色 谱 柱：Halo C18柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm，美国AMT公司)；柱温：25℃；流动相：0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，流速为0.3 mL／min；进样体积：2 μL；梯度洗脱：0～3 min 5% B，3～12 min 5%～12% B，12～29 min 12%～16% B，29～39 min 16%～18% B，39～49 min 18%～21% B，49～53 min 21%～25% B，53～58 min 25%～30% B，58～65 min 30%～36% B，65～73 min 36%～42% B，73～79 min 42%～52% B，79～83 min 52%～65% B，83～98 min 65%～75% B，98～100 min 100% B。 1.5 质谱条件
采用ESI离子源，在正离子模式下进行检测。毛细管电压：4 000 V；干燥气流速：11 L／min；喷雾气压力：241.3 kPa(35 psi)；干燥气温度：350℃；碎片电压：90，180，30，360 V；数据采集范围：m／z50～1 000；选取m／z121.050 9，922.009 8的内标离子作参比离子。每次测定样品前，采用调谐液(Turning mixture)校准质量轴。
2.1 药材提取方法的建立
泽泻药材发挥其药理作用的有效成分主要为泽泻三萜类化合物，属于醇溶性物质，大多采用乙醇提取工艺［10-12］。采用10倍量乙醇加热回流提取，为最大限度地避免目标成分的遗失，再对药渣采取10倍量的水加热回流提取，使药材中可能存在的苷类物质也能被提取得到。 2.2 流动相的选择
在流动相的筛选过程中，使用乙腈作为有机相，水相的选择分别对正离子模式下0.1%甲酸溶液，3 mmol/L乙酸铵溶液，3 mmol/L乙酸铵-0.2%乙酸溶液，5 mmol/L乙酸铵-0.1% 氨水（pH 7.0）体系及负离子模式下的0.1%甲酸溶液进行考察。结果表明采用正离子模式下0.1%甲酸溶液可以获得较好的峰形和分离度，质谱响应良好。故选用正离子模式下0.1%甲酸溶液-乙腈作为流动相进行梯度洗脱。 2.3 碎裂电压的选择
在质谱分析过程中同时设置90，180，300，360 V 4个离子源内碎裂电压，使化合物分子吸收能量后产生电离，生成分子离子，之后进一步按照化合物自身特有的碎裂规律，适当增加碎裂电压，减少簇离子的产生，并同时得到一系列典型的与结构相关的碎片离子信息，便于质谱数据的解析。 2.4 定性方法的建立 2.4.1 数据处理软件
泽泻中存在的萜类成分极性较小，在95 min内得到了较好的有效分离，正离子模式下的特征离子主要为［M+H］+和［M+Na］+，通过一级质谱获得了高分辨的质核比，利用Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis软件在查找到化合物的精确质量数后，将质谱测量误差设置在±5×10-6范围内，计算出该质荷比所代表的化合物可能的元素组成，筛选最可能的化合物分子式，观察其同位素分布情况并进行验证。
2.4.2 数据库的建立
通过泽泻化学成分研究文献及NCBI，CNKI，CA国内外专业数据库等收集了泽泻［6-7，13-19］中的106个化合物，采用安捷伦PCDL软件建立包括化合物名称、分子式、精确相对分子质量的相应的化学成分数据库。通过检索PCDL化合物数据库以及与文献总结中列出的化学成分再次比对，初步推断泽泻供试品溶液中的化学成分。 2.4.3 标准品比对
采用标准品23-乙酰泽泻醇B及24-乙酰泽泻醇A在相同条件下进行对照试验，通过与对照品的保留时间、分子离子和特征碎片离子比对可以确定，在正离子模式下91.077，84.473 min处分别为23-乙酰泽泻醇B及24-乙酰泽泻醇A。 2.5 成分鉴定结果
泽泻提取物的HPLC-TOF-MS总离子流图见图1。三萜类成分结构母核相同，是一类基本母核由30个碳原子组成的化合物。泽泻中的三萜类成分多为原萜烷型四环三萜［5］，其结构具有一定的特征，如C-10位和C-14位上有β-CH3，C-20位上有S构型等，在质谱裂解中呈现一定的规律性。TOF-MS质谱数据及归属见表1，共鉴别出22种化合物。
采用HPLC-TOF-MS法对泽泻提取物中的三萜类成分进行了系统的化学成分分析，共计鉴别了22种化合物，初步确定了泽泻提取物中的主要有效成分，为进一步深入研究泽泻的化学成分含量及开发应用提供一定的参考。
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