氨基酸的分离与提纯
摘 要： 国内外氨基酸分离与提纯的发展研究现状及其在生产实践中的应用。 关键词：氨基酸，分离，提纯，应用 1 前言
氨基酸及其衍生物是组成蛋白质的基本单元，广泛用于医药、食品、饲料、化妆品工业等领域。例如，在食品加工和饲料工业, L-谷氨酸一钠可作为增鲜剂，L-天冬氨酸、甘氨酸和DL-丙氨酸等也用作食品风味改良剂，另外，L-天冬酰苯丙氨酸甲酯作为低热量甜味剂(Aspartame)，在国外已广泛应用于饮料等食品。L-赖氨酸和DL蛋氨酸广泛应用于改进饲料成份的营养价值。L-赖氨酸还用于强化面粉和强化米的生产。在医药卫生方面，除了大量应用结晶氨基酸输液外，某些氨基酸及其类似物也被用于治疗某些疾病。例如L-多巴[L-3-(3，4-二轻基苯基)丙氨酸]是治疗帕金森氏病的重要药物，而α-甲基-多巴为有用的降压药物。L-谷酰胺及衍生物用于治疗胃溃疡，L-色氨酸和5-羟基-L-色氨酸是有效的抗抑郁剂。另外某些氨基酸衍生物具有抗肿瘤的作用。一些肽类例如催产素，血管紧张肽和促胃液激素等，它们具有医疗效果的激素效应。氨基酸聚合物，例如聚-γ-甲基-L-谷氨酸已被用作人造革的原料。总之，氨基酸及其衍生物将会随着科学研究和工业生产的发展，而被更加广泛地应用 。然而，国内氨基酸的生产远不能满足其需求。 2 氨基酸的性质
氨基酸是一种具有两性官能团的物质。氨基酸分子既含有氨基又含有羧基，在溶液中主要以—NH3，—C00形式存在。氨基和羧基的电离取决于溶液的pH值和氨基酸的等电点Pl：在pH低于等电点P1时，羧基的电离被抑制，氨基酸带正电荷；在pH值高于等电点Pl时，氨基的电离被抑制而带负电荷。在等电点时，氨基酸的溶解度最小，最易从溶液中析出。按照侧链基团的不同，氨基酸可以分为3类：酸性氨基酸，中性氨基酸，和碱性氨基酸。而各种氨基酸的等电点不同，酸性氨基酸＜中性氨基酸＜碱性氨基酸。利用这个性质，可以把它们进行分离提纯。 3氨基酸的分离与提纯
[2]
—
+
[1]
氨基酸的分离提纯可采用沉淀、离子交换、溶剂萃取法、反向微胶团萃取、液膜萃取和电渗析等方法。最常用的是离子交换法。近年来，新的氨基酸分离提纯方法的研究十分活跃，报道最多的是反应萃取、反向微胶团萃取和液膜萃取等。 3.1特殊沉淀法
1
特殊沉淀法
[14]
是最早应用于混合氨基酸分离的方法之一。某些氨基酸可以与一些有机或无机化合物
结合，形成结晶性衍生物沉淀，利用这种性质向混合氨基酸溶液中加入特定的沉淀剂，使目标氨基酸与沉淀剂沉淀下来，达到与其他氨基酸分离的目的。较为成熟的工艺有：精氨酸与苯甲醛在碱性和低温条件下，可缩合成溶解度很小的苯亚甲基精氨酸，分离这种沉淀，用盐酸水解除去苯甲醛，即可得精氨酸盐酸盐
[4]
；亮氨酸与邻—二甲苯-4-磺酸反应，生成亮氨酸的磺酸盐，后者与氨水反应得到亮氨酸。
[1]
特殊沉淀法虽然操作简单、选择性强，但是由于沉淀剂回收困难，废液排放污染加剧，残留沉淀剂的“毒性”等已逐渐被其他分离方法所取代。 3.2离子交换法
英国曾经成功地开发了将胱氨酸母液通过离子交换层析柱分离出精氨酸、组氨酸和赖氨酸；前苏联也有过以离子交换层析法从胱氨酸母液中提取精氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和异亮氨酸的报道
[6]
[5]
；国内的许多研究单位及胱氨酸生产单位开展了大量的关于离子交换法从蛋白水解液中提取氨基酸工
[1，4，7，8]
艺的研究。
刘艳梅（1979年3月5日），女，硕士在读，主要研究方向：清洁生产与资源回收。
尽管氨基酸的存在形态A所呈现的净电荷为零，但是这类存在形态几乎不溶于普通有机溶剂中。因此，采用通常的溶剂萃取是不能奏效的。目前人们采用了两种形式的离子交换反应萃取。一种是在高pH下萃取氨基酸阴离子，另一种是在低pH下萃取氨基酸阳离子
[9]
[10]
±
。季铵盐(如甲基三辛基氯化铵TOMAC)
和酸性磷氧类萃取剂[如二(2-乙基已基)磷酸D2EHPA]是典型的阴离子萃取剂和阳离子萃取剂。
Nato等人
[11]
研究了高pH时，TOMAC对各种氨基酸的萃取平衡。氨基酸阳离子和季铵盐阳离子之间
发生离子交换。不同氨基酸的萃取平衡常数有很大的差异。对色氨酸所获得的萃取平衡常数最大。它是甘氨酸萃取平衡常数的260倍。萃取平衡常数KA值同Nazaki等人提出的氨基酸的亲油比关联较好。Haensel
[10]
等人用TOMAC作载体对D，L-苯丙氨酸的反应萃取作了平衡研究。由于缓冲离子与OH竞争萃
—
取，平衡常数受到初始pH值的影响。另外，氨基酸的浓度越低，则季铵盐浓度对分配系数的影响就越大。在实验室规模的脉冲筛板塔中，氨基酸反应萃取实验结果表明
[12]
，季铵盐对氨基酸的反应萃取存在
一定的障碍。由于季铵盐较高的表面活性，使脉冲筛板塔中的反应萃取操作在两相通量较低以及振幅、频率较低的范围之内，故脉冲筛板塔的效率较低
文献
[15，16]
[13]
。
研究了用D2EHPA-煤油溶剂萃取异亮氨酸的反应机理，表明D2EHPA—煤油溶剂体系对于芳
[17]
香族氨基酸、亮氨酸、异亮氨酸及碱性氨基酸中的精氨酸都有着较好的分离效果。文献研究了D2EHPA
—煤油溶剂萃取苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸的萃取规律及其温度效应，发现萃取分配比与氨基酸的结构有关，它取决于氨基酸中A基团的极性、所含的碳原子数和氨基酸的空间结构。萃取反应为放热反应，温度升高对萃取不利。苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、异
2
亮氨酸和精氨酸在D2EHPA-煤油溶剂中的分配比较高，具有一定的工业应用前景，而酸性氨基酸基本上不被萃取。文献
[18]
研究了D2EHPA与各种氨基酸在酸性条件下的萃取平衡，确定了萃取反应式和萃取平衡
常数，并考察了有机溶剂、溶液的pH值、萃取剂的浓度对分配比以及氨基酸的性质对萃取效果的影响，发现D2EHPA对碱性氨基酸的萃取效果最好，对酸性氨基酸则最差，对中性氨基酸而言，苯丙氨酸、亮氨
酸和缬氨酸的效果最好，而酪氨酸、丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的效果最差。
离子交换法分离混合氨基酸仅仅是利用各种氨基酸之间等电点的差异，因此只有当欲被分离的混合氨基酸之间的等电点相差较大时才能较好地分开，对于等电点相近的混合氨基酸只能部分得以分开或根本就难以分离；氨基酸离子在树脂中的扩散速度较慢，因此一方面要求料液的流速较低．另一方面对于氨基酸浓度较高的料液在上离子交换柱前还要进行稀释，这就必然导致所需的设备太大；此外，离子交换法由于本身的生产原理决定了生产过程难以连续化。所以离子交换法用于混合氨基酸的分离并没有在大规模生产中推广开来3.3萃取法 3.3.1溶剂萃取法
由于氨基酸是离子型化合物，它们在非极性溶剂中的溶解度很低，因此物理萃取法难以用来提取氨基酸。早期采用正己胺和含4~5个碳原子的低级醇作为萃取剂从蛋白水解液中萃取分离十几种氨基酸
[19]
[14]
。
。
但这种萃取剂的分配系数低，分离系数差，对萃取柱的高度要求很高，一般要有30~40理论级才能有满意的分离效果。
近些年来先后开发了化学萃取法分离提取氨基酸，其中有机胺类和以有机磷酸为应用最多的两大类萃取剂
[20~25,]
，尤其是在有机磷酸为萃取剂的萃取过程研究很多，并开发大量的工艺过程。采用高级脂肪
酸，如月桂酸、硬脂酸、棕榈酸和油酸可以有效地萃取分离碱性氨基酸。这些脂肪酸无毒、价廉。但是，碱性氨基酸比较容易用离子交换法有效地分离。萃取法分离碱性氨基酸恐怕难有商业应用前景氨基酸不溶于水，而易溶于液氨的性质，发展了液氨萃取技术
[27，28]
[26]
。利用
。应用这种技术，在蒸发了氨后，可
获得氨基酸的极好结晶。可以将戊二酸、谷氨酸、天门冬氨酸和亚胺二醋酸从其相混合的氨基酸中分离。
化学萃取法分离混合氨基酸主要也是利用不同氨基酸之间等电点差别，与离子交换法相似，只有当混合氨基酸之间的等电点相差足够大时才能被萃取分离开，对于等电点相近的氨基酸如中性氨基酸，它们的等电点几乎一致，因此化学萃取法是难以分离混合氨基酸的。 3.3.2反胶团萃取法
反胶团萃取法分离氨基酸是从80年代末兴起的氨基酸分离技术。用于萃取氨基酸的反胶团的种类有限，主要集中于以下两类：一类是以AOT[琥珀酸二(2-乙基己基)酯磺酸钠]为代表的磺酸盐形成的反胶团；一类是有机胺盐表面活性剂形成的反胶团。这两类反胶团萃取氨基酸的共同缺点是只有在氨基酸
3
水溶液中的无机盐浓度较低时才具有应用价值。因此这两类反胶团只能应用于从无机盐浓度较低的料液如发酵液中萃取分离氨基酸，对于像胱氨酸母液含大量无机盐的氨基酸料液，这两类反胶团就无法应用。 针对国外报道的反胶团存在的缺点，翁连进
[33~35]
开发了一种新的反胶团，以二异辛基磷酸铵表面活
性剂形成的反胶团，这种反胶团具有比以上两类反胶团更强的萃取能力，在盐酸浓度高达4.5mo1／L的胱氨酸母液中仍具有令人满意的萃取率。通过改变混合氨基酸水溶液中无机盐的种类或浓度，使等电点相近的氨基酸在同一种反胶团中的分配系数产生较大的差别，实现等电点相近的混合氨基酸的分离。根据这一观点，翁连进已成功地开发了从胱氨酸母液中提取精氨酸的工艺
[24]
，该工艺采用4级萃取，3级
洗涤，可使反胶团中精氨酸的纯度大于98%，整个工艺精氨酸的回收率大于98%，而目前工业上应用离子交换法从胱氨酸母液中提取精氨酸的工艺的回收率仅10％。 3.3.3液膜萃取
液膜萃取是将第三种液体展成膜状以便隔开两个液相，利用液膜的选择透过性，使料液中的某些组分透过液膜进入接受液，然后将三者各自分开，从而实现料液组分的分离
Thien等人
[37]
[36]
。
最先对氨基酸在乳状液膜中的传递进行研究。他们采用NaD2EHPA为载体研究了乳状液
膜体系中各种参数，如外相pH值、表面活性剂浓度、载体浓度、搅拌速度，以及内相初始盐酸浓度等对L-苯丙氨酸传递的影响，并且获得了最优化条件。实验证明，经过一次间歇操作以后，80％的L-苯丙氨酸可以从外相转移到内相，而且内相L-苯丙氨酸的浓度是外相的8倍。实验表明，任何一个过程参数的变化都会影响到溶质的分离和浓缩的效率。乳状液膜系统的优化必须根据溶质分离和浓缩的相对重要性来确定。支撑液膜萃取综合了膜过程和溶剂萃取过程的优点，萃取和反萃取过程同时进行，减少了有机相的使用量。Deblay等人
[38]
用支撑液膜回收、浓缩和纯化由微生物发酵生产的氨基酸。从没有过滤
的发酵液中萃取缬氨酸的实验表明，由于杂质的存在，分离性能明显下降，但是缬氨酸的传递仍然是最有效的，而且对缬氨酸的选择性大约是染料的10倍、葡萄糖的100倍、蔗糖的1000倍以上。 3.4毛细电渗析
以集成电路为基础的毛细电渗析，通过添加少量溶解聚合物，可明显提高肽缩氨酸和氨基酸的溶解与分离
[39]
。毛细电渗析已成为一种应用广泛的分离大范围多种类无机或有机化合物的方法。它可以与传
[40]
统的色谱分离方法相媲美。因为它的高分离效率使之在生物化学中变得越来越重要4 结 论
。
利用我国来源充足、价格低廉的自然资源为原料生产氨基酸前景是十分广阔的。我国的人发、动物毛发、蹄角等角质蛋白原料数量大,而且又有比较完整的购销网络,虽然目前在分离提纯上还存在一些问题,但根据我们的设计和实验说明,随着新技术的推广应用,生产装备的不断完善,综合利用和环保意识的逐步增强,我国氨基酸生产的产量、质量、规模和效益都会有一个较大幅度的提高。
4
Separation and Purification of Amino Acids
Abstract: the technique of separation and purification of amino acids domestic and abroad are reviewed. Briefly expatiate the application in practice. Key words: amino acids; separation; purification; application; 参考文献
[1]周骏山.实用氨基酸手册[M]. 无锡市氨基酸研究所.19,2
[2]戴 红,张宗才,张新申.制革废弃物中氨基酸的提取和分离. 氨基酸和生物资源[J],2003 ,25(3): 46~48
[3]董军芳,林金清,谭平华,曾颖. 分离提纯氨基酸的新方法.福建化工[J],2002（1）: 34~36 [4]李良铸,由木金,卢盛华.生化制药学[M].北京:中国医药科技出版社,1991 [5]Shakalo VF.BP1314708 [6]USSR 163188
[7]季浩宇. 离子交换法从生产胱氨酸废液中分离提取三种碱性氨基酸. 氨基因杂志[J],1994(2): 19~22
[8]潘秋霞,王春生. 用732阳离子交换树脂提取碱性氨基酸的工艺研究.氨基酸杂志[J],1994（2）: 23~24
[9] Haensel R,Halwachs W, Schugerl K. Chem Emg Sci[J],1986,41: 1811~1815 [10] Teromoto M, Miyake Y, Matsuyama H,et al. ISEC’90,Kyoto,1990 [11]NatoT, Ohtake T, Matsumoto M, et al,J Chem Eng Japan,1991,24: 20~24
[12]Schlichting E, Halwachs W, Schiigerl K, Chem Eng Procexx[J],1985, 19: 317~328 [13]刘阳生, 戴猷元, 汪家鼎. 萃取分离氨基酸研究进展, 现代化工[J].1998(8): 8~12 [14]翁连进.混合氨基酸的分离技术.化工进展[J].2000（2）: 51~53
[15]Liao Shisu, Lin Zhou, Jiang Ganbua, Zhang Delong Solvent Extraction and Ion Exchange[J], 1993,11(5), 849~859
[16] Masaaki Teramoto, yoshikazu Miyake, Hideto Extraction of Amino Acids with Organophosphorus Extractant[J].1993:25~26
[17]相群星. 用D2EHPA对不同结构氨基酸萃取行为研究. 清华大学化工系,1988年毕业论文
[18]曹汉瑾,王德宝,刘沛研等. 二（2-乙基己基）磷酸对氨基酸的萃取平衡. 高等学校化学学报[J]. 1996,17（3）386~388
5
[19] Clyd C.dewott, Lansing, and Mertrn W, Fogie, Midland. Mich. US24954 [20] Weber Alfred, Wilke Detlef, Kurzidion Johannes, Kennecke Mario. USP 44067
[21] Teramoto Massaki, Nara Hiroshi, Matsuyama Hideto, Miyake Yoshikazu. Pro Symp Solvent Extr[J], 19: 23~28
[22] Stienman Thomas J, Mattison Phillip L. EP 353728
[23] Liao Shisu, Lin Zhou, Jiang Ganhua, Zhang Dclong. Solvent Extraction and Ion Exchange[J], 1993,11(5):849~859
[24] Marie Christine Bitar, Jean Louis Sabot, Paul Aiollet[J]. EP251852
[25] Tuominen Franis W, Swanaon Ronald R, Mattison Phillip L, Mackay Kemmeth D, USP4886888 [26]张德隆,廖史书. 溶剂萃取法分离氨基酸的最新进展. 氨基酸和生物资源[J]. 1995,17（3）: 51~54 [27] C.A.56: 606
[28] Nakamura, Walumio(Sagami Chemical Research Center)Japan 74 14,727 [29] Shintam Furusaki, Kazuyuki Kishi, J Chent Eng Jpn[J], 1990, 23(1): 91~93 [30] Epaminondas B Leodidis, T Alan Hatton, J Phya Cham[J], 1990,94: 00~11
[31] Motonari Adachi, Makoto Harada, Akihiaa Shioi, Yasuo Sato, Jphys Chem[J], 1991(95): 7926~7931
[32] Wenhua Wang, Martin E Weber, Juan H Vers. Ind Eng Chem Res[J], 1995(34): 599~606 [33]翁连进. 反向胶团萃取氨基因的研究:[学位论文].上海:华东理工大学,1997
[34]翁连进, 金浩, 宋兴福, 江体乾. 反胶团萃取赖氨酸的分配系数.华东理工大学学报[J], 1998, 24（6）: 650~654
[35]翁连进, 金浩, 宋道云, 江体乾. 磷酸二异辛酯微乳液体系萃取组氨酸的分配系数. 高校化学工程学报[J], 1998, 12（3）: 242~247
[36]刘红, 潘红春. 液膜萃取技术在生物工程领域的应用研究进展. 膜科学与技术[J], 1998, 18（3）: 10~14
[37] Itoh H, Thien M P, Hatton TA, et al. Biotech Bioeng[J], 1990,35: 853~860 [38] Deblay P, Minier M,Remon H. Bioeng[J], 1990. 35: 123~131
[39] Hong Chen, Yong Zeng, Bi-Feng Liu. Influence of soluble polymer polyvinylpyrrolidone on separation of small peptides and amino acids by microchip-based capillary electrophoresis. Analytical and Bioanalytical Chemistry[J]. Volume 373,Numbers 4~5
[40] Lili Yang, Zhuobin Yuan. Comparison of enantioseparation of amino acid derivatives in
6
aqueous andmixed aqueous-organic media by capillary zone electrophoresis. Fresenius J Anal Chem[J] (1999)365: 541~544
7
