植物雌雄蕊发育过程的观察

一、实验目的

1.了解雄蕊的结构，掌握花药的发育过程及成熟花药的基本结构。

2.了解雌蕊以及胚珠的基本结构，掌握胚囊的发育过程及成熟胚囊的结构。

3.了解制作石蜡切片的基本过程以及关键步骤的基本原理。

二、实验原理

雄蕊是被子植物花的雄性生殖器，是雄花的一部份。其作用是产生花粉。位于花被的内方或上方，在花托上呈轮状或螺旋状排列。数目因植物种类而异。雄蕊由花丝和花药两部分组成。花丝是蕊基部的柄状部分，起支持和伸展花药的作用，结构简单,外由表皮包被,中间为维管束,表皮与维管束之间为薄壁组织。花药包括4个花粉囊,形成药隔,包括药隔薄壁组织和药隔维管束。花粉囊均由幼小花药每一角隅处的一群皮下原始细胞(孢原细胞)发育而成。孢原细胞经过平周形成外方的初生周缘层和内方的初生造孢层,初生周缘层细胞经过多次平周和垂周,产生由外向内的药室内壁。中层和绒毡层,随着花药的进一步发育,药室内壁发生纤维状增厚成为纤维层,绒毡层和中层则被吸收消失。通常每个花药由两个药瓣组成，每个药瓣有两个花粉囊，其中有花药壁和产生小孢子的药室（孢子囊）。每个孢子囊中有许多小孢子母细胞，它们各自经减数后，产生四个单倍体的小孢子。此后每个小孢子（核）又一次，形成一个大的营养细胞（或称管核），和一个小的生殖细胞（核），这时具两细胞的花粉粒（即雄配子体）基本成熟。花药成熟时纵裂,花粉散出。发育成熟的花药结构包括表皮、药隔、花粉囊三部分。

雌蕊一般由柱头、花柱和子房构成，总体呈现柱状，一般位于植物雌花的中心位置，花柱较大。柱头是雌蕊顶端接受花粉的部分。通常膨大成球状，圆盘状或分枝羽状。常具乳头状突起或短毛，利于接受花粉。花柱是雌蕊柱头和子房之间的部分，连接柱头和子房，是花粉管进入子房的通道。其长度因植物种类而不同。当花粉管沿着花柱生长并伸向子房时，花柱能为其提供营养和某些趋化物质。授粉后，子房发育成了果实。柱头和花柱枯萎，脱落。子房是雌蕊基部的膨大部分，内有1至多室，每室含1至多个胚珠。经传粉受精后，子房发育成果实，胚珠发育成种子。

胚珠由珠柄、珠被、珠孔和珠心所组成，珠柄为连接胚珠与胎座的短柄，其内的维管束将胚珠与子房连接起来以传递营养与激素。发育的胚珠最初是一整团珠心组织，由于基部的细胞较快而形成一层或两层包被层—珠被，将其他珠心组织包裹在内并在一端留下一个小孔—珠孔。多数被子植物均有内、外两层珠被。珠被、珠心基部与珠柄汇合的部位称为合点,是珠柄维管束进入胚囊的位置。被子植物成熟的胚珠，包括珠心和珠被两部分。珠心是胚珠的最重要部分，内有胚囊和卵。珠被是珠心外围的保护组织，通常分为外珠被和内珠被两层。胚珠起源于子房壁内表皮下的一团细胞，称胚珠原基。原基前端发育成珠心，基部形成珠柄，并在珠心中发生胚囊。珠心基部的细胞较快，形成珠被。珠被逐渐向上扩展，将珠心包围于其中，仅在顶端留一小孔，称为珠孔。珠孔是花粉管到达胚囊的通道。珠柄并入胚珠本体的地方，也是珠被与珠心合并的区域，称为合点，由心皮进入珠柄的维管束经合点入胚珠或在这里终止。受精后，整个胚珠发育成种子。

胚囊是被子植物特有的雌配子体结构,参与其有性生殖的许多过程。花粉在柱头上萌发形成花粉管,胚囊参与引导花粉管向胚珠方向生长；而受精作用是在胚囊中进行的,胚囊产生的许多物质参与并介导了这一过程；在受精过程中,胚囊的细胞骨架引导一个精子移向卵细胞,另一个精子移向细胞；同时,胚囊中表达的基因参与诱导种子的发育,并在胚和胚乳发育过程中继续发挥作用。一般为\"七胞八核\"(即7个细胞,8个细胞核)的结构，包括一个

卵细胞、两个助细胞、一个大细胞（大细胞内含有两个极核）和3个反足细胞。受精后，受精卵在胚囊内发育成胚，受精的极核发育成胚乳。正常型是在减数形成的四个细胞中，有三个退化，剩下的含有一个核的胚囊细胞，核三次，成为八个核，三个集中到近珠孔端，形成卵器，三个集中到近合点端，形成反足细胞，二个核移至胚囊形成极核。助细胞一般寿命短，在花粉管进入胚囊前后即行消失。反足细胞寿命也短，但其中也有在数量、大小上均增加而显有原叶体迹象的。此外，也有从卵细胞以外的细胞发育成胚的（多胚形成）。卵是胚囊的重要组成部分。它与 2个助细胞构成卵器。卵细胞在朝珠孔方向的壁较厚，朝合点端的壁逐渐变薄。两个助细胞彼此接触，朝珠孔端略尖或弯曲。助细胞的壁不完整，从珠孔端向合点端方向助细胞壁逐渐变薄。无壁区的助细胞原生质由双层膜隔开：其中一层为助细胞膜，另一层为细胞膜。每个助细胞的珠孔端有丝状器，丝状器是一团指状细胞壁内突，类似于“传递细胞”的壁。细胞为胚囊中的最大细胞。其细胞壁从胚囊的珠孔端到合点端，变化很大。在棉花中与珠心相邻的那一部分壁较厚。卵和助细胞突进细胞的部分看来没有胞壁。细胞与卵、助细胞和反足细胞之间通过胞间连丝联系。细胞核一般2个,称极核，位于细胞或靠近侧面的细胞质中。细胞富有各种细胞器，有具淀粉的质体，线粒体，高尔基体也很多，许多核糖体常以单个或多核糖体形式存在。反足细胞 胚囊吸器

石蜡切片技术是组织学、发育生物学研究的主要实验方法，同时也是病理学中观察病理变化的重要手段，广泛地应用于临床病理诊断、教学和科研工作中。动、植物标本的形态学观察、免疫组化、原位杂交及原位PCR等技术手段，都离不开标本组织的处理和石蜡切片的制作。

常规石蜡切片的制作过程包括石蜡组织块制作、切片制作和染色，具体的制作过程是：取材→固定→冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→烤片→染色→封固。固定是为了使组织在石蜡切片制作过程中保持细胞的形态结构，使之与存活的原有形态和结构相

似而不发生变形。固定后，为避免残留的固定液个制片带来影响，应依据固定液的种类和性质选择相应冲洗剂进行洗涤。脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，并使组织进一步硬化，为下一步透明及浸蜡创造条件。脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象。透明是让组织中的脱水剂被透明剂所代替，使石蜡顺利地渗人组织中，增强组织的折光系数。浸蜡的目的是使石蜡逐渐浸入组织间隙，取代透明剂，达到包埋的支持作用。包埋则进一步加强了组织的硬度和韧度而便于进行切片。染色是利用染料在组织切片上给与颜色，使组织细胞的各种微细结构在显微镜下能显现不同颜色，便于观察。封固是为了使切片能长期保存。

三、实验材料与试剂

1.材料：紫叶李花蕾

2.器具：石蜡切片机、包埋机、水浴锅、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、刀片、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。

3.试剂：卡诺固定液（无水乙醇、冰醋酸3:1）、无水乙醇、95%乙醇、异丁醇、石蜡、明胶、苏木精、盐酸、伊红、中性树胶

四、实验步骤

1.取材：采取紫叶李尚未开放的花蕾若干，注意不要损伤实验部位。

2.固定：将采取的花蕾浸入卡诺固定液中，40-60分钟，使花蕾透明可见即可；若材料不立即处理，可将其依次放入95%，90%，80%，70%乙醇溶液中，每次半个小时，最

后转入70%酒精中保存。

3.脱水：将清洗后的材料进行脱水，依次放入95% 酒精1小时或伊红染液过夜，95% 酒精1h，100%酒精1h， 100%酒精1小时。

4.透明：将脱水后的材料依次放入以下溶液中进行透明：2/3 100%酒精+1/3异丁醇1小时 ，1/2 100%酒精+1/2异丁醇1小时，1/3 100%酒精+2/3异丁醇1小时，异丁醇30分钟，异丁醇30分钟；在透明过程中， 如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。

5.浸蜡：在包埋机中，依次将材料加入以下溶液：2/3异丁醇+1/3石蜡1h，1/2 异丁醇+1/2石蜡1h，1/3 异丁醇+2/3石蜡1h，纯蜡2h ，纯蜡2h或过夜。

6.包埋：调整好包埋架的位置，使蜡块的大小适当。将熔化的石蜡倒入包埋架，再将组织块置于石蜡中摆正位置，若位置有偏移，应尽快调整。待石蜡表面凝固后将蜡块放入凉水中，使其加速冷凝，蜡条完全冷凝后去掉包埋架，由于标本较多，所以每包埋完一个标本，用解剖针在蜡块上面刻上标本编号并置于4℃冰箱内冷凝备用。

7.切片：取出蜡块，用刀片将其削成长方形整齐的小块，使组织横截面离蜡块表面约0.5cm。再用熔蜡将休整后的蜡块固定在蜡棒上。用AO手摇切片机切片，厚度为5微米。在37℃水浴锅中充分展片后，用涂抹了Mayer氏蛋白贴剂（蛋清、甘油、麝香草酚，其中前两者的比值是1：1）的载玻片贴片。将贴好的切片放在40℃烘箱中烘干，最少4小时，一般的要一天以上。

8.展片和粘片：将洗净、烘干的玻片排列放置在玻片架上，将明胶放入70℃的水浴加

热溶解，再将放有玻片的玻片架放入明胶内蘸浸片刻，取出放在室温待干备用。将切好断开的石蜡切片置于40℃的恒温水浴锅里，让其充分伸展。然后粘贴蜡片，再用载玻片捞取尽可能伸展较好的石蜡切片，调整好切片在玻片上的位置，每个标本横切、纵切各制作3～4个片。最后贴上标签，放入35℃的烘箱中烘干，使玻片的水分完全蒸发，蜡片紧贴玻片。

9.染色：

（1）脱蜡：将制好的玻片依次放入以下溶液中处理：异丁醇30分钟，异丁醇30分钟，1/2 100%酒精+1/2异丁醇5分钟，100%酒精2-3分钟，100%酒精2-3分钟，95%酒精1-2分钟，95%酒精1-2分钟，90%酒精1-2分钟，80%酒精1-2分钟，70%酒精1-2分钟，蒸馏水1-2分钟；

（2）染色：将材料进行以下操作，苏木精染色15分钟，自来水冲洗3分钟以上，1%盐酸酒精浸泡8秒，自来水冲冼20分钟，蒸馏水浸泡2分钟，70%酒精浸泡1分钟，80%酒精浸泡1-2分钟，90%酒精浸泡1-2分钟，0.5%伊红酒精溶液染色3-5分钟，95%酒精冲洗30秒，95%酒精浸泡1-2分钟，100%酒精浸泡2分钟，100%酒精浸泡2分钟，异丁醇浸泡2分钟，异丁醇浸泡2分钟。

10.封片：在异丁醇未完全干时用中性树胶封片，置于阴凉处风干。

11.镜检： 将组织切片置于光学显微镜下观察, 并拍照。

五、预期实验结果

细胞浆红色，细胞核蓝紫色。

六、参考文献

[1]袁艺，蔡平，江佳富，熬成奇，孙江华，Kerry O.Britton.葛藤雌雄蕊发育的研究[J].生物学杂志，2001.18（5）26-27.

[2]侯春春，徐水.浅析影响石蜡切片质量的关键因素[J].中国农学通报，2009.25（23）94-98

[3]邵继荣，朱雪梅，任正隆.植物胚囊发育的细胞与分子生物学研究[J].四川农业大学学报，2004.22（1）83-87