鉴定基因启动子区相关转录因子基因的方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 106929597 A(43)申请公布日 2017.07.07

(21)申请号 201710320047.X(22)申请日 2017.05.09

(71)申请人 贵州大学

地址 550025 贵州省贵阳市花溪区贵州大

学北校区科学技术处(72)发明人 许厚强　周迪　陈琨　陈伟　

赵佳福　段志强　王圆圆　(74)专利代理机构 贵阳中新专利商标事务所

52100

代理人 李亮　程新敏(51)Int.Cl.

C12Q 1/68(2006.01)C12N 15/85(2006.01)C12N 15/65(2006.01)

(54)发明名称

鉴定基因启动子区相关转录因子基因的方法

(57)摘要

本发明公开了一种鉴定基因启动子区相关转录因子基因的方法，本发明将扩增的转录因子基因片段与用高保真DNA聚合酶扩增出的载体-启动子片段进行平末端连接，构建重组质粒。这种方法能简便精确获得重组载体，具有不受任何酶切位点的优势，能准确的连接任何需要研究和验证的相关转录因子基因片段，使实验结果的准确性和便捷性增强，实验结果更加可信。

权利要求书1页 说明书7页 附图3页

CN 106929597 ACN 106929597 A

权　利　要　求　书

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1.一种鉴定基因启动子区相关转录因子基因的方法，其特征在于：以载体片段，待鉴定的基因启动子的核心片段以及相关转录因子基因的CDS区序列片段共同构建启动子-转录因子真核表达载体；将构建的启动子-转录因子真核表达载体通过转染小鼠成纤维细胞，观察转染的小鼠成纤维细胞中是否有绿色荧光信号，从而鉴定出该转录因子基因是否为基因启动子能启动的转录因子。

2.根据权利要求1所述的鉴定基因启动子区相关转录因子基因的方法，其特征在于：所述的启动子-转录因子真核表达载体的构建方法包括如下步骤：

1)通过PCR扩增获得载体-基因启动子片段；

2)通过PCR扩增获得转录因子基因CDS区序列片段；

3)将载体-基因启动子片段与转录因子基因CDS区片段进行平末端连接；4)将步骤3)获得的连接产物转化到大肠杆菌，筛选出阳性克隆子，测序验证获得重组载体。

3.根据权利要求2所述的鉴定基因启动子区相关转录因子基因的方法，其特征在于：步骤1)和步骤2)中PCR所用的扩增酶为高保真的DNA聚合酶。

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说　明　书

鉴定基因启动子区相关转录因子基因的方法

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技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其是一种鉴定基因启动子区相关转录因子基因的方法。

背景技术[0002]DNA的转录除了需要RNA聚合酶的作用外，还需要多种辅助因子。这些辅助因子称为转录因子，能够识别并结合DNA的顺式作用位点，从而目的基因在特定的时间与空间以特定的强度表达。因此，研究转录因子与启动子之间的相互作用，对于了解启动子的功能具有重要意义。目前鉴定启动子和转录因子相互结合的方法有酵母单杂交、染色质免疫共沉淀法、电泳迁移率变动分析等方法；但以上方法相对操作比较复杂，需要较多的人力耗费和试剂、耗材花费。寻找一种简单便捷、易于操作的鉴定启动子和转录因子相互结合的方法能很大程度的解决实验问题。

发明内容[0003]本发明的目的是：提供了一种鉴定基因启动子区相关转录因子基因的方法，它能快速、准确的鉴定出转录因子基因是否为基因启动子能启动的转录因子。[0004]本发明是这样实现的：鉴定基因启动子区相关转录因子基因的方法，以载体片段，待鉴定的基因启动子的核心片段以及相关转录因子基因的CDS区序列片段共同构建启动子-转录因子真核表达载体；将构建的启动子-转录因子真核表达载体通过转染小鼠成纤维细胞，观察转染的小鼠成纤维细胞中是否有绿色荧光信号，从而鉴定出该转录因子基因是否为基因启动子能启动的转录因子。[0005]所述的启动子-转录因子真核表达载体的构建方法包括如下步骤：[0006]1)通过PCR扩增获得载体-基因启动子片段；[0007]2)通过PCR扩增获得转录因子基因CDS区序列片段；[0008]3)将载体-基因启动子片段与转录因子基因CDS区片段进行平末端连接；[0009]4)将步骤3)获得的连接产物转化到大肠杆菌，筛选出阳性克隆子，测序验证获得重组载体。[0010]步骤1)和步骤2)中PCR所用的扩增酶为高保真的DNA聚合酶。[0011]与现有的技术相比，本发明将扩增的转录因子基因片段与用高保真DNA聚合酶扩增出的载体-启动子片段进行平末端连接，构建重组质粒。这种方法能简便精确获得重组载体，具有不受任何酶切位点的优势，能准确的连接需要研究和验证的相关转录因子基因片段，使实验结果的准确性和便捷性增强，实验结果更加可信。附图说明[0012]图1为关岭牛血液DNA提取；[0013]图2为关岭牛组织RNA提取；

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图3为Myf5、MyoG基因扩增；

图4为pEGFP-N3-MyoD1-Myf5重组载体单酶切及pEGFP-N3-MyoD1-MyoG重组载体单图5为pEGFP-N3-MyoD1-Myf5、pEGFP-N3-MyoD1-MyoG重组载体测序结果；图6为C2C12细胞培养图；

图7为pEGFP-N3-MyoD1-Myf5转染细胞及pEGFP-N3-MyoD1-MyoG转染细胞；图8为本实施例的操作流程图。

酶切；

[0016][0017][0018][0019]

具体实施方式[0020]本发明的实施例1：鉴定基因启动子区相关转录因子基因的方法，具体如下：[0021]一、菌株以及试剂的准备[0022]菌株：大肠杆菌感受态细胞DH5α购自大连Takara公司；[0023]试剂来源：高保真的DNA聚合酶、脂质体2000购自美国Invitrogen公司，dNTP Mix购自大连Takara公司，T4DNA Ligase购自大连Takara公司，DNA Marker购自大连Takara公司；胎牛血清、DMEM高糖培养基、OPTI-MEM、胰酶购gibco公司，C2C12细胞购自中科院上海细胞库。[0024]RNA提取试剂盒购自Omega公司，柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，柱式DNA胶回收试剂盒购自(Axygen)，无内毒素质粒提取试剂盒(QIAGEN)。[0025]其它试剂均为国产分析纯。[0026]试剂配制：[0027]Kana(50mg/ml)：称取Ampicillin 5g，加100ml超纯水溶解，0.22μm过滤除菌后，按1ml/份分装，-20℃保存。[0028]LB液体培养基：称取胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl 1g，置于100ml三角瓶中，加入95ml超纯水溶解，调pH值至7.0，加超纯水至总体积为100ml，121℃高压灭菌20min，冷却至室温，-4℃保存，临用时加入抗生素，硫酸卡那霉素的工作浓度为50μg/ml。[0029]LB固体培养基：称取胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl 1g，，琼脂1.5g置于100ml三角瓶中，加入95ml超纯水溶解，调pH值至7.0，加超纯水至总体积为100ml，高压灭菌后冷却至45℃左右，加入硫酸卡那霉素(50μg/ml)，摇匀后倒入培养皿。[0030]10％细胞培养基：取50ml胎牛血清加入到450mlDMEM高糖培养基。[0031]二、重组质粒的构建[0032]1.RNA的提取及反转录实验[0033]做此实验必须做好消毒灭菌的工作并戴好口罩和手套，防止RNA和cDNA被污染。[0034](1)从关岭牛背最长肌中提取总RNA，具体步骤如下：[0035]A、取黄豆粒大小组织用剪刀剪碎放入研钵，加入液氮研成粉末，将组织粉末转移至1.5ml的无酶EP管中。[0036]B、加入1ml的RNA-Solv试剂，用移液轻轻地吹打混匀至细胞充解。[0037]C、将上述液体转移到一个1.5ml无酶离心管中，室温孵育3min。[0038]D、加入0.2ml氯仿，在振荡器上震荡15s混匀。冰浴10min。[0039]E、4℃、12000rpm/min离心15min。

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F、转移70％的上层液体至新的离心管中，添加1/3体积无水乙醇，涡旋震荡15s。

[0041]G、吸取650μl的混合液体至吸附柱中，室温10000rpm/min离心60s。弃滤液。[0042]H、重复上一步骤继续加入混合液，直到加完。[0043]I、将吸附柱置于一个新的2ml的收集管中，加入300μl的RNA Wash BufferⅠ，室温10000rpm/min离心60s，弃滤液。[0044]J、再加入400μl的RNA Wash BufferⅠ，室温10000rpm/min离心60s，并弃滤液。[0045]K、添加RNA Wash BufferⅡ500μl，室温10000rpm/min离心60s，弃滤液。重复此步骤。[0046]L、空离，13000rpm/min空离2min。[0047]M、将柱子放置于新的1.5ml离心管，加入40μl DEPC水洗脱，室温放置2min，全速离心1min。[0048]得到总RNA。在紫外可见分光光度计下检测后放置于-20℃冰箱中保存。[0049](2)cDNA的合成，将获得的RNA稀释至100ng/μl。具体步骤流程如下：[0050]A、溶解所需的试剂。[0051]B、添加试剂至总体积为13μ1。DNTP Mix(2.5mM Each)4μl；Primer Mix，2μl；RNA Template，2μl；RNase-Free Water，5μl。[0052]C、70℃孵育10min，冰浴2min。[0053]D、之后短暂离心一会，使管壁上的液体全部回到管底。[0054]E、继续向以上反应液中加入以下的试剂，终浓度为1x的5XRT Buffer 4μl；终浓度为10mM的DTT 0.1m 2μl。[0055]F、用移液吹打混匀，42℃水浴2min。[0056]G、加1μl HiFis Cript(200.U/PI)，轻轻拍打混匀，于42℃水浴锅中孵育50min。[0057]H、85℃孵育5min，短暂离心。[0058]经紫外可见分光光度计检测DNA浓度后放置于-20℃冰箱中保存待用。[0059]2.反应结束后，取5μlDNA、RNA产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测(凝胶成像结果如图1、2所示)[0060](1)加入1.0g的琼脂糖至100ml TAE电泳缓冲液中[0061](2)微波炉中加热使琼脂糖完全溶解，溶液冷却至60℃，加入Goldview染料5.0μl，轻轻摇匀。[0062](3)倒胶，厚度为0.3～0.5cm，然后放置好梳子[0063](4)待胶冷却后，轻轻拔掉梳子，置于电泳槽中，加电泳缓冲液至完全覆盖胶面[00](5)上样，电泳，稳压100V，30～40min[0065](6)取出凝胶，在紫外灯下检查凝胶，并用凝胶成像系统记录结果。[0066]3.PCR扩增关岭牛Myf5、MyoG基因CDS区序列引物[0067]表1 PCR扩增的引物信息

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以获得的关岭牛组织cDNA为模板进行PCR扩增。总反应体系为20μl，其中模板1μl，

上、下游引物各1μl，5×PCR buffer 4μl，dntp1.6μl，高保真的DNA聚合酶0.2μl，ddH2O补至20μl。扩增条件：98℃预变性3min；98℃变性10s、退火30s、72℃延伸，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。反应结束后，用1.0％琼脂糖凝电泳检测PCR产物，如图2所示。[0070]4.pEGFP-N3-MyoD1载体质粒的提取[0071]质粒小量提取试剂盒抽提后用于后续实验。提取方法如下：[0072](1)在含有硫酸卡那霉素的培养基中接种目标菌种，于37℃摇床充分震荡培养12～16h。[0073](2)对于高拷贝的质粒，去1.5～5ml菌液，于室温，8000×g离心2min收集菌体，倒尽或者吸干培养基。[0074](3)在菌体沉淀中加入250μl BufferP1，吸打或震荡至彻底悬浮菌体。如果使用Visualyse，则在加入250μlP1后再加入1μlVisualyse，震荡均匀。[0075](4)加入250μl BufferP2，立即温和颠倒离心管5～10次混匀，室温静置2～4min。[0076](5)加入350μl Buffer P3，立温和颠倒离心管5～10次充分混匀。[0077](6)于离心管最大转速(≥12000×g)离心5～10min，将上清全部小心移入吸附柱，9000×g离心30sec。倒掉收集管中液体，将吸附柱放入同一收集管中。[0078](7)在吸附柱中加入500μl去蛋白液BufferDW1，9000×g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。[0079](8)向吸附柱中加入500μl Wash Solution，9000×g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。[0080](9)重复步骤8一次。[0081](10)将空吸附柱和收集管放入离心机，9000×g离心1min。[0082](11)在吸附膜加入50～100μl Elution Buffer，室温静置1～2min，9000×g离心1min。将所得到的DNA溶液至于-20℃保存或用于后续实验。[0083](12)然后用1.0％琼脂糖凝电泳检测PCR产物。[0084]5.PCR扩增含MyoD1基因启动子区的pEGFP-N3载体片段[0085]以pEGFP-N3-MyoD1质粒为模板进行PCR扩增。总反应体系为20μl，其中模板1μl，上、下游引物各1μl，5×PCR buffer 4μl，dntp1.6μl，高保真的DNA聚合酶0.2μl，ddH2O补至20μl。扩增条件：98℃预变性3min；98℃变性10s、59℃退火30s、72℃延伸2min，10个循环；98℃变性10s、60℃退火30s、72℃延伸2min，25个循环；72℃延伸10min；4℃保存。反应结束后，

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用1.0％琼脂糖凝电泳检测PCR产物。[0086]6.DNA胶回收试剂盒回收PCR产物[0087](1)通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其它片段分开，用干净的手术刀片将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5ml离心管中，称重。[0088](2)按每100mg琼脂糖中加入300～600μl的溶胶液BufferB2，充分混匀。[00](3)将离心管置于50℃水浴5～10min，间或混匀，直至胶块完全熔化，将融化好的溶液全部转移至吸附柱中，8000×g室温离心30sec，倒掉收集管中的液体将吸附柱放入同一个收集管中。[0090](4)将吸附柱中加入500μl Wash Solution，9000×g室温离心30sec，倒掉收集管中的液体将吸附柱放入同一个收集管中。[0091](5)重复步骤(4)一次。[0092](6)将空吸附柱和收集管放入离心机9000×g离心1min，除去残留的漂洗液，将吸附柱室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液。[0093](6)取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，向吸附柱中间部分滴加15～40μl ddH2O，室温静置1～2min。9000×g室温离心1分钟洗脱DNA，收集管中溶液，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。[0094]7.将pEGFP-N3-MyoD1基因启动子片段分别与Myf5、MyoG基因片段进行平末端连接[0095]酶切产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化，通过T4DNA Ligase进行连接，连接体系：

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混匀反应液，16℃连接过夜。[0098]8.连接产物转化DH5α菌株[0099]转化的步骤如下：[0100](1)取100μl感受态细胞，置于冰上，3～5min至刚刚融化。[0101](2)将上述的连接液全部加入感受态细胞中，轻轻混匀，甩下冰上放置30min。[0102](3)42℃水浴热激90sec，迅速冰上放置15～20min。[0103](4)加入37℃预热的600μl LB培养基，混匀后37℃200～250rpm振荡培养1小时，使细胞恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗硫酸卡那霉素抗性基因。[0104](5)室温下4000rpm离心5min，用头吸掉450μl上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。[0105](6)将细菌涂布在预先用硫酸卡那霉素涂布的LB固体培养基上。[0106](7)平板在37℃下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。[0107]9.重组质粒的筛选[0108]挑去平板上的单菌落进行菌落PCR，菌落PCR的体系为总反应体系为20μl，其中菌液1μl，扩增MyoDI启动子片段的上、下游引物各1μl，5×PCR buffer 4μl，dntp1.6μl，高保

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真的DNA聚合酶0.2μl，ddH2O补至20μl。扩增条件如前面介绍的扩增MyoDI启动子片段的条件。挑取能PCR出正确目的条带的菌落接种到含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中扩大培养。然后用质粒DNA抽提试剂盒提质粒，用性内切酶EcoRⅠ酶切验证连接是否正确。[0109]10.将验证得到的质粒送测序公司测序(如图5所示)[0110]11.将构建好的pEGFP-N3-MyoD1-Myf5、pEGFP-N3-MyoD1-MyoG重组质粒进行无内毒素质粒提取，步骤如下：[0111](1)取5ml已转化目的载体的菌液于10ml离心管中1000rmp离心1min。[0112](2)去上清加入250μL SolutionI/RNAaseA重悬菌体。[0113](3)加入250μL SolutionII到菌液中，轻轻地上下颠倒离心管几次，使液体混匀，室温孵育2min。[0114](4)加入125μL预冷的Buffer N3于混合液中，轻轻地上下颠倒离心管几次，使液体混匀，12000rmp 4℃离心10min。[0115](5)将上清转移至1.5ml离心管中，向其中加入0.1倍体积的ETR Solution,轻轻地上下颠倒几次离心管，混匀后冰浴10min。[0116](6)冰浴结束后42℃水浴5min，12000rmp室温离心3min。[0117](7)吸取上清，将上清转移至新的1.5ml离心管中，并向其中加入0.5倍体积的无水乙醇，上下颠倒几次混匀液体，室温孵育2min。[0118](8)将混匀好的液体转移至放有HiBindTM DNA Mini Column的2ml离心管中，1000rmp室温离心1min。[0119](9)弃去下层收集管中的液体，向吸附柱中加入500μLBuffer HB，1000rmp室温离心1min。[0120](10)弃去下层收集管中的液体，向吸附柱中加入700μL含有无水乙醇的Wash Buffer，1000rmp室温离心1min。[0121](11)重复第10步。[0122](12)弃去管中的液体将吸附柱13000rmp离心3min，此步骤的目的是除净残留的乙醇。[0123](13)将吸附有质粒DNA的吸附柱置于一个新的无菌1.5ml离心管中，向柱中心加入30-50μL Endotoxin-Free Elution Buffer，13000rmp离心1min收集质粒DNA。[0124]12.pEGFP-N3-MyoD1-Myf5、pEGFP-N3-MyoD1-MyoG无内毒素质粒转染C2C12细胞，步骤如下：、[0125]将C2C12细胞按1×105/孔的密度接种于24孔培养板，加DMEM高糖培养液(含10％胎牛血清，100l/ml卡那霉素，100l/ml氨苄霉素)500l，37℃、5％CO2培养至细胞融合度为80％左右。将前期成功构建的pEGFP-N3-MyoD1-Myf5、pEGFP-N3-MyoD1-MyoG载体分别转染C2C12细胞。各转染组每孔载体用量为1g，脂质体用量为1μl，载体和脂质体分别用无血清的Opti-MEM稀释(24孔板用50μl稀释)，转染24h后荧光倒置显微镜下观察转染效率。观察结果发现，通过荧光显微镜观察到绿色荧光信号。实验结果证明，Myf5、MyoG基因为MyoD1基因启动子的相互结合转录因子。[0126]本发明的实施例2：鉴定基因启动子区相关转录因子基因的方法，实验方法及流程同实施例，验证MyoD1基因启动子与转录因子SP1基因，构建获得pEGFP-N3-MyoD1-SP1重组

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表达载体，筛选出阳性克隆子、测序验证，将正确载体转染C2C12细胞，通过荧光显微镜未观察到绿色荧光信号。实验结果证明，SP1基因不是与MyoD1基因启动子的相互结合转录因子。

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